肿瘤的发生和发展是个多因素多步骤的过程，而各个因素之间的相互作用是通过不同的信号转导通路来实现的。体内外的各种刺激均会激活细胞内不同的信号转导通路，其中PI3K/AKT/mTOR是与细胞增殖和细胞凋亡关系最密切的信号转导通路之一，也是参与乳腺癌发展的重要信号转导通路^[1-2]。而在这条信号转导通路中，mTOR作为一种具有丝/苏氨酸激酶活性的磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶家族中的一种蛋白，与细胞的生长，细胞周期的调节，细胞的凋亡有密切的关系^[3]，与蛋白的转录与翻译关系密切^[4-5]。在该信号转导通路中起重要调节作用，最终调控细胞周期和细胞凋亡。本研究通过脂质体介导转染pcDNA3.1-mTOR导入人乳腺癌MCF-7细胞中，观察转染后mTOR蛋白，磷酸化AKT，PTEN表达的变化；以及它们对MCF-7细胞生长作用的影响，从而探讨PI3K/AKT/mTOR信号转导通路中，mTOR蛋白的变化对乳腺癌细胞的影响及对该条信号转导通路中AKT和PTEN的负反馈作用。

细胞由人乳腺癌细胞株MCF-7购自上海麦莎生物有限公司。质粒与菌株pcDNA3.1-mTOR为本人制备，DH5α由实验室保存。兔抗磷酸化AKT（p-FAK，Ser-473）单克隆抗体、兔抗mTOR多克隆抗体及兔抗mTOR多克隆抗体均为Abcam产品，深圳晶美公司代理。Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒购自美国Invitrogen，质粒大提试剂盒为Qiagen产品。

乳腺癌细胞在10% FBS（胎牛血清）的培养基中种植，37 ℃，5% CO₂饱和湿度培养箱中培养。

通过脂质体介导把DNA转染入悬浮或贴壁细胞中。分离稳定转染体：在完全培养基中孵育48~72 h后，用胰酶消化细胞并用合适的选择培养基重铺细胞。每2~4 d更换培养基，持续培养2~3周。

质粒pcDNA3.1 -mTOR及空载质粒转化感受态细胞DH5α，37 ℃培养24 h；挑选阳性克隆，培养90 min提取质粒；限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；扩增质粒并提取纯化。

PCR检测mTOR的表达。

转染48 h后，收集细胞，提取总蛋白进行电泳，转膜，一抗4 ℃过夜，二抗室温2 h，增强化学发光法(ECL)显影。

细胞转染后接种于6孔板培养，隔日换培养基。每种细胞7个孔。每日取1种细胞1孔进行计数，连续观察7 d。绘制细胞生长曲线。

收集转染后48 h的各实验组及对照组细胞，冷磷酸缓冲液洗涤2遍，1 ml 70%冷乙醇固定过夜处理，碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期。ModFit软件分析。

SPSS19.0进行t检验和相关性分析。

pcDNA3.1-mTOR，空载质粒及脂质体转染细胞后，PCR鉴定转染成功（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 转染后PCR鉴定图 Figure 1 PCR for verification of mTOR transfection in the cells.

转染mTOR，空载质粒及未转染组细胞生长图见图 2，从图 2明显可见转染野生型mTOR组细胞的生长可速度明显增快，而未转染组和转染空载体质粒组增快变化不显著。

图 2(Figure 2)

图 2 三组细胞生长图 Figure 2 Cell growth in the 3 groups after transfection.

转染mTOR基因后，其表达明显升高，与转染空质粒后有明显差异；转染mTOR后，AKT也随之表达增加而PTEN的表达明显下降，与其他2组有明显差异（图 3）

图 3(Figure 3)

图 3 转染后mTOR，AKT及PTEN蛋白的表达图 Figure 3 Expression of the mTOR, AKT, and PTEN proteins in the cells after transfection. Lane 1: Non-transfected cells; Lane 2: Cells transfected with the non-loaded plasmid; Lane 3: Cells transfected with pcDNA3.1-mTOR.

流式细胞术检测可见，mTOR转染组的细胞凋亡率达（8.2±1.3）%，与对照组相比明显升高（P < 0.01）。转染空质粒组的细胞凋亡率（4.3±0.8）%，与对照组相比变化不显著（表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 转染前后流式细胞检测比较 Table 1 Cell cycle distribution and cell apoptosis of the cells in the 3 groups detected by flow cytometry G1 S G2/M AP pcDNA3.1-mTOR 52.2±6.7 31.2±3.2 I6.6±1.9 8.2±1.3 pcDNA3.1 60.3±5.6 21.4±4.3 15.3±4.7 4.3±0.8 MCF-7 65.4±4.8 19.4±3.8 I4.6±2.I 3.4±l.l

表 1 转染前后流式细胞检测比较 Table 1 Cell cycle distribution and cell apoptosis of the cells in the 3 groups detected by flow cytometry

mTOR信号转导通路在调节细胞的凋亡、增生、分化等活动中起着重要作用，与恶性肿瘤的发生、发展关系密切。mTOR信号转导通路与PI3K/AKT信号转导通路的密切的关系越来越受到重视。AKT的磷酸化使mTOR活化，使P70S6K、4E-BP1活化，4E-BP1磷酸化后失活，使之与eIF-4E分离，并与其他翻译起始因子结合，启动蛋白质的合成^{[1-2, 6]}。

本研究将携带有mTOR的质粒导入MCF-7细胞中，发现细胞的mTOR蛋白的表达增强，磷酸化AKT的表达明显增强；而转染未携带有mTOR质粒的MCF-7细胞mTOR的表达不增强，AKT的表达也无明显改变。说明mTOR对PI3K/AKT/mTOR信号转导通路具有明显的负反馈作用。转染前后肿瘤细胞的凋亡率有显著意义的改变也提示mTOR可促进肿瘤细胞的生长。此结果与国内外的的报道一致^[7-8]。而转染前后PTEN蛋白相应的改变说明，mTOR与PTEN呈明显负相关。有文献说明，AKT的活化直接磷酸化mTOR使之活化后作用于下游与翻译有关的P70S6K，EIF4E及翻译抑制蛋白4E-BPs，并能直接磷酸化PTEN，激活蛋白的转录，从而在转录水平和翻译水平上对肿瘤细胞的蛋白进行调节^[9-10]。甚而有研究发现，mTOR的特异性抑制剂可以促进PTEN蛋白的表达，从而抑制肿瘤地增长^[11-12]。

本试验对抑癌基因PTEN和基因mTOR表达的相关性研究，进一步证明PTEN作为一种重要的抑癌基因，在体外对乳腺癌细胞有重要的影响。其主要的作用机制，可能通过PI3K/AKT/mTOR信号转导通路，调控mTOR的表达，利用mTOR对蛋白转录和翻译的重要调控作用，影响乳腺癌细胞的生长；也说明，mTOR对PTEN具有负反馈的调节作用。这个结果提高了我们对呈网络状的信号转导通路相互作用的认识，为寻找肿瘤细胞药物治疗的靶点提供了理论基础；也为mTOR特异性的抑制剂在乳腺癌治疗中的作用提供了理论基础。