臭氧(Ozone，O₃)是一种广泛存在于空气中的二次污染物。研究表明，臭氧对呼吸道有严重损伤作用，可引起以中性粒细胞增多为主的炎症反应。众多研究表明Ca²⁺与炎症反应密切相关^[1-4]。瞬时感受器电位通道(TRPC)是位于细胞膜上的一类重要的非选择性阳离子通道，主要介导钙离子和钠离子内流。TRPC家族包括7个成员，即TRPC1-7。TRPC1是最早被克隆的哺乳动物TRPC通道，也是近年来研究最热门的TRPC通道之一。本课题组前期研究表明，TRPC1在卵白蛋白诱导的哮喘小鼠肺组织中表达升高^[5]，提示TRPC1有可能在变应原引起的以嗜酸性粒细胞增多为主的炎症反应中起促进炎症发生发展的作用。TRPC1是否在臭氧诱导的炎症反应中起作用，目前未见相关报道。本研究通过臭氧暴露建立小鼠肺组织炎症模型，研究小鼠肺组织中TRPC1与肺组织炎症的关系，旨在为极其复杂的肺组织炎症反应调控网络补充新的内容。

清洁级BALB/c雌性小鼠14只，6~8周龄，体质量15~18 g，由广东省医学实验动物中心提供。随机将小鼠分为对照组(control group)和臭氧组(O₃ group)，每组7只。

Trizol (Invitrogen公司)，RT-PCR试剂(TAKARA公司)，一抗为兔抗小鼠TRPC1多克隆抗体(Abcam公司，ab74919)，二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (北京鼎国，进口分装)，浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥公司)，L-小型臭氧发生器(广州康利科技有限公司)，便携式臭氧检测仪(深圳沃塞特科技有限公司)。

将小鼠放入小鼠隔离器中饲养，适应环境1周。臭氧组小鼠于适应环境后的第1天、第3天、第5天在2.0 ppm臭氧环境中暴露3 h；对照组于相同环境下新鲜空气暴露。

末次暴露24 h后，戊巴比妥钠麻醉小鼠，仰卧位固定，气管插管，解剖分离出左肺后结扎左主支气管，每次以0.4 ml PBS灌洗右肺，反复灌洗回收3次(回收率大于80%)，收集的BALF于4℃、1500 r/min离心10 min，细胞用1 ml PBS重悬，吹打均匀后取10 μl于血细胞计数板上进行白细胞总数计数，余下的BALF于4℃、1500 r/min离心10 min，弃上清，取细胞沉淀涂片，用姬姆萨染色法在光学显微镜下进行细胞分类计数(每例随机计数100个细胞)。

肺组织用4%多聚甲醛溶液固定，常规制备病理切片，苏木精-伊红(HE)染色后观察肺组织病理变化。

取肺组织100 mg，加入1 ml Trizol试剂，按试剂说明书提取总RNA，在ND-1000型核酸蛋白测定仪上测RNA的浓度及纯度。按照试剂盒的说明书进行RT-PCR。引物序列：TRPC1上游引物序列5'-CAAGATTTTGGGAAATTT CTGG -3'；下游引物序列5'-TTTATCCTCATGATTTGCTAT-3'，扩增片段长度372 bp。GAPDH上游引物序列5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'；下游引物序列5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，扩增片段长度455 bp。反应条件：(1)94℃预变性5 min；(2)94℃变性15 s、53℃退火15 s、72℃延伸30 s，TRPC1进行35个循环，GAPDH进行30个循环；(3)延伸5 min。PCR产物进行琼脂糖电泳。Image J软件对条带进行光密度分析，以目的基因与GAPDH的光密度之比作为其相对表达量。

从液氮中取出肺组织剪碎，放入EP管中，加入裂解液及蛋白酶抑制剂，匀浆、煮沸、离心后，将上清移入另一EP管。用BCA法测定蛋白浓度。各组取50 μg蛋白样品于10% SDSPAGE凝胶电泳，电湿转法将蛋白转印至PVDF膜上。将PVDF膜取出放入TBST溶液洗10 min×3次，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h，3%牛血清白蛋白稀释一抗(1: 1000)4℃冰箱摇动孵育过夜。次日，TBST洗膜10 min× 3，加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (1:5000)，水平摇床室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，经ECL化学发光剂曝光5 min，用Image J软件分析条带光密度值，蛋白表达水平以其与GAPDH光密度值比值表示。1.3.6免疫组织化学法观察TRPC1蛋白的定位石蜡切片脱蜡水化，95℃左右抗原修复15 min，0.3% H2O2-甲醇室温封闭孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶，1 mol/L PBS冲洗3 min×3次，正常山羊血清37℃封闭20 min，滴加一抗(1:100)37℃孵育1 h，1 mol/l PBS冲洗3 min×3次，以PBS代替一抗作阴性对照。滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(1:200)，37℃孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次。DAB显色，蒸馏水冲洗，终止显色。苏木精复染，1%盐酸酒精分化，自来水冲洗，中性树脂封片，显微镜下观察。阳性表达为细胞内呈棕黄色颗粒改变。同一光强度下，光学显微镜(×200)随机选取5个视野拍照保存，Image-pro Plus (IPP)6.0图像分析系统检测累积光密度值(IOD)，计算TRPC1蛋白阳性相对表达量。

实验数据用均数±标准误表示，采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析，显著性检验用t检验，相关性分析采用Pearson直线相关法。P < 0.05为差异有统计学意义。

臭氧组小鼠表现为烦躁不安、呼吸急促、节律不齐、腹肌痉挛、大小便失禁；持续的臭氧应激后，部分小鼠出现喘息或哮鸣音。对照组未见上述改变。

由表 1可见，与对照组相比较，臭氧组小鼠BALF中白细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数显著增多(P < 0.05)，以中性粒细胞增多为主。

表 1(Table 1)

表 1 BALF的细胞分类计数 Table 1 Cell counts in the BALF (×104/L, Mean±SD) Group Total WBC Macro Neutro Lympho Eosino Control 16.96±1.71 16.29±1.64 0.24±0.03 0.08±0.01 0.42±0.04 O3 55.8±3.75* 50.29±3.37* 3.35±0.22* 1.96±0.13* 0.52±0.06 *P < 0.05 vs control group.

表 1 BALF的细胞分类计数 Table 1 Cell counts in the BALF (×104/L, Mean±SD)

对照组小鼠光镜下可见肺泡结构完整，肺泡腔内无渗出液，支气管上皮细胞排列有序，有少量环形气道平滑肌且不连续(图 1A)；臭氧组小鼠肺组织光镜下可见肺泡壁结构受损，肺间质充血，支气管管腔狭窄，上皮有脱落，气道平滑肌增厚且连续，气管和血管周围可见炎性细胞浸润(图 1B)。

图 1(Figure 1)

图 1 肺组织形态学改变 Figure 1 Morphological changes of the lung tissues (HE staining, original magnification: × 200). A: Control group; B: O3 group.

RT-PCR结果显示，臭氧组小鼠肺组织TRPC1 mRNA表达量为0.32±0.04，对照组为0.15±0.03(图 2)。两组相比，臭氧组TRPC1 mRNA表达明显增强。

图 2(Figure 2)

图 2 RT-PCR法检测两组小鼠肺组织中TRPC1 mRNA的表达情况 Figure 2 mRNA expressions of TRPC1 in mouse lung tissues detected by RT-PCR. *P < 0.05 vs control group. 1: Control group; 2: O3 group.

Western blot结果(图 3)发现，对照组和臭氧组小鼠肺组织TRPC1蛋白表达量分别为0.25±0.05和0.47±0.04，差异有统计学意义(P < 0.05)。免疫组织化学结果(图 4)显示，对照组小鼠肺组织中肺泡上皮和支气管上皮细胞有少量阳性表达，其他部位表达不明显，而臭氧组小鼠肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞和浸润的炎症细胞表达均较对照组增强，且对照组和臭氧组TRPC1蛋白阳性表达的IOD分别为16656.10±1405.22和67820.56±5098.49，差异有统计学意义(P < 0.05)。

图 3(Figure 3)

图 3 Western blot法检测两组小鼠肺组织中TRPC1蛋白表达情况 Figure 3 Protein expressions of TRPC1 in mouse lung tissues detected by Western blotting. *P < 0.05 vs control group.

图 4(Figure 4)

图 4 免疫组织化学法观察两组小鼠肺组织中TRPC1蛋白表达的定位 Figure 4 Localization of TRPC1 protein in mouse lung tissues detected by immunohistochemistry (Original magnification: ×400). A: Control group; B: O3 group.

相关性分析显示，小鼠肺组织中TRPC1 mRNA表达与BALF白细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数呈显著性正相关(r分别为0.826、0.823、0.842和0.841，P < 0.01)，TRPC1蛋白表达也与BALF白细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数呈显著性正相关(r分别为0.863、0.860、0.878和0.878，P < 0.01)。

钙离子作为第二信使，广泛参与细胞中各种生命活动。胞内Ca²⁺稳态失衡是影响细胞生理功能的重要因素，细胞内Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)调节主要依靠：肌浆内质网钙池系统中Ca²⁺释放以及胞外Ca²⁺通过离子通道如电压依赖性钙通道，钙库操纵性钙通道(store-operated calcium channels, SOCC)或受体操纵性钙通道内流。对于兴奋性细胞来说，电压操纵性钙通道是胞外钙内流的主要途径，但大部分非兴奋性细胞没有电压操纵性钙通道，钙库操纵性钙内流(store-operated calcium entry, SOCE)是非兴奋性细胞钙内流的主要途径^[6]。SOCC由基质交联分子1(STIM1)、钙释放激活钙通道蛋白(Orai)和TRPC构成。在多种细胞中发现，TRPC1与STIM1、Orai共同调节SOCE^[8-10]，TPRC1被认为是构成SOCC最有可能的TRPC通道。有研究显示，SKF96365(SOCC的抑制剂)能抑制小鼠淋巴细胞的活化和增殖，也可以抑制刀豆蛋白A和PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate)/离子霉素诱导的炎性细胞因子的释放^[11]。这些研究提示TRPC1可能与炎症有关。

有研究报道核转录因子-kappa B (NF-κB)和TRPC1在血管紧张素Ⅱ诱导的SOCE和人脐静脉内皮细胞通透性中起重要作用，TRPC1引起的SOCE依赖于NF-κB的激活^[12]。Lin等^[13]研究发现，在人结肠肌成纤维细胞系CCD-18细胞中，TNF-α通过NF-κB途径可诱导TRPC1蛋白表达增加和TRPC1介导的钙离子内流，NF-κB的特异性抑制剂SN-50作用后抑制了TRPC1的表达和减弱了钙离子内流^[13]。Paria等^[14-15]发现在人肺动脉内皮细胞中，凝血酶通过激活NF-κB能促进TRPC1 mRNA和蛋白的表达增加，从而使TRPC1诱导的钙离子内流和内皮细胞通透性增加，且在TRPC1的5'-调控区发现有3个NF-κB的结合位点。这些研究提示NF-κB可能作为上游调控TRPC1的表达，而NF-κB途径与炎症密切相关，TRPC1可能通过NF-κB的调控参与炎症反应。本次试验首次发现，臭氧暴露后，BALB/c小鼠肺组织的TRPC1 mRNA和蛋白质表达上调，进一步研究提示蛋白定位在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞和浸润的炎症细胞上。且TRPC1 mRNA和蛋白质的表达与与肺泡灌洗液中白细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数呈显著正相关。提示，TRPC1可能参与臭氧暴露导致的肺组织炎症。

综上所述，TRPC1在臭氧导致的炎症中起重要作用，有可能成为肺部炎症疾病治疗的靶点，但其具体作用机制及其与NF-κB的关系有待进一步探讨。