宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌^[1]。顺铂（cisplatin, DDP）广泛应用于恶性肿瘤的化学治疗，宫颈癌新辅助化疗方案多以顺铂为基础，疗效肯定。但顺铂的毒性反应突出，主要为肾功能损害、耳毒性、血液毒性、胃肠道反应等，寻找一类安全可靠的可增强肿瘤化疗敏感性的基因靶点药物以降低DDP用量、减轻毒副作用，具有重要的应用价值。

信号转导和转录激活子-1（signal transducers and activators of transcription1, Stat1）被认为是一种抑癌因子，可通过直接调控多种靶基因的转录如c-Myc，CDKs等调控肿瘤细胞的生长与凋亡^[2-3]。癌基因c-Myc与肿瘤的发生、发展和演变转归有重要关系，宫颈癌等多种肿瘤中都有c-Myc基因的扩增或过度表达^[4]。T细胞淋巴瘤和卵巢癌的研究发现Stat1可以改善肿瘤细胞对化疗药物耐药性^[5-6]。而Stat1及c-Myc在宫颈癌化疗敏感性中的研究，尚未见文献报道。

本研究通过研究顺铂、Stat1-siRNA处理宫颈癌Hela细胞后Stat1、c-Myc表达及细胞生长、增殖能力的差异，探讨Stat1蛋白对于Hela细胞生长与增殖的影响以及Stat1、c-Myc在宫颈癌顺铂化疗敏感性中的作用及机制，为开发协同顺铂化疗的基因靶点药物提供实验依据。

人宫颈癌细胞株Hela由中国科学院细胞库提供，注射用DDP购自江苏豪森药业股份有限公司，3（-4，5-二甲基噻唑-2）-2、5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝，MTT）购自美国Sigma公司，BrdU试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，兔抗Stat1抗体、β-actin抗体、兔抗c-Myc抗体均购自美国Abcam公司，应用于RNA干扰实验的对照小RNA片段Con-siRNA和Stat1干扰片段Stat1-siRNA均购自上海纽恩生物技术有限公司，细胞转染试剂lipo-2000购自美国Life Technology公司。

人宫颈癌细胞Hela在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的1640高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱内常规传代培养。实验用细胞均为对数生长期细胞。

在6孔细胞培养板中种入状态良好的Hela细胞1×10⁵/ml，8 h后，依据lipo-2000转染试剂说明书加入适量lipo-2000转染试剂和50 ng/ml的Stat1-siRNA及其对照siRNA，24 h后取细胞裂解提蛋白。

提取各组全细胞蛋白质，Bradford法测定蛋白质含量。按每孔10 μg上样，常规SDS-PAGE电泳。电泳完成后以半干式电泳转移法将蛋白条带转移到PVDF膜上。电转完成后取出PVDF膜，3% BSA 4℃封闭过夜。倾去BSA，在其上加入相关蛋白的一抗，β-actin作为内参与PVDF膜在室温共孵育2 h。PBS漂洗后再分别用结合辣根过氧化物酶的二抗孵育。ECL化学发光法进行显色，X光胶片上曝光，随后显影、定影，用图像分析系统测定蛋白条带的光密度，进行定量分析。

收集各组处于对数生长期的Hela细胞，把细胞悬液浓度调节为1×10⁵/ml。将100 μl（含1×10⁴ cell）的细胞悬液种入每孔中，每组设5个复孔，种5块96孔板。置于37 ℃，5% CO₂培养箱孵育，把种板时间作为起始时间点0 h，在0 h取出一块96孔细胞培养板，每孔加入10 μl 0.5% MTT溶液，继续培养4 h。离心（1000 r/min×10 min），小心吸掉孔内上清液，每孔均加入100 μl二甲基亚砜，将96孔板置摇床上，低速振荡10 min，充分溶解结晶物。在酶联免疫检测仪OD490 nm，分别测量各孔的吸光值。同时设置调零孔（MTT、培养基、二甲基亚砜）。此后每隔1 d取1块培养板检测490 nm的D值，一共检测5 d。

细胞以1.5×10⁵/ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中（内放置一盖玻片），培养1 d，用含0.4% FCS培养液同步化3 d，使绝大多数细胞处于G0期。终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30 μg/L），37 ℃，孵育40 min。弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。甲醇/醋酸固定10 min。经固定的玻片空气干燥，0.3% H₂O₂甲醇30 min灭活内源性氧化酶。5%正常兔血清封闭。甲酰胺100 ℃，5 min变性核酸。冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗兔抗BrdU单抗（工作浓度1: 50），阴性对照加PBS或血清。按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数。

采用SPSS 17.0统计软件储存和分析数据，计量资料以均数±标准差表示，两个独立样本均数比较呈正态分布的采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

为了在Hela细胞中验证DDP对Stat1表达的影响，分别用0，2.5，5，10 mg/L浓度的DDP处理Hela细胞48 h，收集细胞进行蛋白提取，经过电泳、转膜和抗体杂交得到Western blot结果（图 1）。结果显示：DDP刺激Hela细胞48 h后，随着DDP浓度的升高，Stat1表达逐步增加，在5 mg/L时与对照组比较有显著差异（P < 0.001）；至10 mg/L时更明显，上调蛋白表达量超过2倍，说明DDP可上调Stat1的表达，Stat1的上调程度与DDP处理浓度成正相关。

图 1(Figure 1)

图 1 不同浓度DDP处理Hela细胞后Stat1蛋白的表达 Figure 1 Expression of Stat1 protein in Hela cells exposed to different concentrations of DDP.

用化学合成的Con-siRNA和Stat1-siRNA分别用脂质体转染Hela细胞48 h，收集细胞，进行处理后，进行western blot检测（图 2）。结果显示：Stat1-siRNA转染的Hela细胞中Stat1蛋白的表达量较阴性对照Con-siRNA转染组显著下调，通过灰度分析得出可下调70%左右，说明Stat1-siRNA转染Hela细胞后可有效下调Stat1蛋白的表达。

图 2(Figure 2)

图 2 Stat1沉默后蛋白的表达 Figure 2 Expression of Stat1 protein in Hela cells after Stat1 gene silencing.

为验证DDP是否可以通过上调Stat1来达到抑制Hela细胞生长增殖的作用，用DDP（10 mg/L）联合Stat1-siRNA处理Hela细胞，得到四个实验组，Con-siRNA，Stat1-siRNA，DDP + Con-siRNA以及DDP + Stat1-siRNA，采用MTT及Brdu实验检测各组细胞生长与增殖情况。在细胞培养期间，每24 h取细胞转移到96孔板，加MTT，490 nm检测吸光值，一共测5个时间点，每个检测点3个平行，取每个检测点的平均值做折线图，得到MTT结果（图 3A）。同样的分组，BrdU 24 h四组增殖能力无明显变化（图 3B），但在48 h时，亦得到MTT相同的结果。结果显示：Stat1-siRNA组Stat1下调，Hela细胞的生长增殖状态最佳，DDP组Hela细胞生长增殖抑制最明显；DDP+Stat1沉默组Hela细胞的生长增殖介于DDP组及Stat1-siRNA组之间，说明Stat1抑制Hela细胞生长增殖；DDP通过上调Stat1抑制细胞生长增殖；下调Stat1后，DDP对Hela细胞生长增殖的抑制作用被削弱。

图 3(Figure 3)

图 3 Hela细胞生长（A）和增值能力（B）的变化 Figure 3 Cisplatin inhibits the proliferation of Hela cells by up-regulating Stat1 expression.

Western blot实验验证DDP是否可以通过上调Stat1来抑制其下游因子c-Myc蛋白的表达，采用检测前述各组细胞，得到。结图 4果表明：未经DDP处理的两组，c-Myc蛋白表达高于DDP处理的两组；DDP未处理组中，Stat1沉默组c-Myc蛋白的表达高于空白对照组；经DDP处理的两组中，DDP+Stat1沉默组c-Myc蛋白表达高于DDP组；同时可以看出，DDP+Stat1沉默组c-Myc蛋白的表达，介于DDP组及Stat1沉默组之间，说明：Stat1可介导DDP对c-Myc抑制作用；DDP通过上调Stat1抑制c-Myc的表达，下调Stat1后，DDP对c-Myc蛋白表达的抑制被削弱。

图 4(Figure 4)

图 4 四组Hela细胞c-Myc蛋白的表达 Figure 4 Expression of c-Myc protein in Hela cells after Stat1 gene silencing.

酪氨酸蛋白激酶-信号传导和转录激活因子（janus kinase-signal transducers and activators of transcription, JAK-Stats）途径是一条极为快速的信号通路, 激活后，可以将细胞外信号传递到细胞核^[7]。在人类多种实体肿瘤（如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等^[8-10]）和血液病^[11-12]（如淋巴瘤）的研究中发现，其参与了肿瘤发生、发展、浸润和转移。Stat1是其中重要成员之一，参与细胞生长调节、抗病毒和免疫防御^[13]，主要可触发抗增殖和促凋亡反应，在肿瘤细胞和免疫系统中被认为是一种肿瘤抑制因子^[3]。Stat1主要是直接通过对多种靶基因的转录调控如c-Myc, CDKs等^[2-3]，或间接地通过调节肿瘤血管生成、组织浸润或抗肿瘤免疫反应对肿瘤细胞生长和凋亡进行调控。而宫颈癌细胞中Stat1及c-Myc的相关研究较少。

Beppuetal研究发现，IFN-γ可同时促进宫颈癌细胞系Caski中Stat1（促凋亡）和NF-κB（抑凋亡）表达上调，当IFN-γ和环孢菌素A（抑制NF-κB活性）同时使用时，生长停滞明显增加^[14]。本研究通过用靶向Stat1干扰RNA对Hela细胞进行转染，有效沉默Stat1的表达后发现Stat1对Hela细胞的生长与增殖有抑制作用，同时发现在宫颈癌Hela细胞中c-Myc受到Stat1的调控，c-Myc的表达量与细胞的生长增殖状态呈正相关。c-Myc基因是最早于禽类骨髓瘤病毒中发现的一种癌基因，其表达水平与细胞的增殖及分化状态有关，其表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥作用^[4]。结合文献得出，在宫颈癌Hela细胞中，癌基因c-Myc具有促进其生长增殖的作用，c-Myc是Stat1发挥抑癌作用的靶点基因。

DDP是广谱抗癌药，属细胞周期非特异性药物，主要作用靶点为DNA，属细胞周期非特异性药物，在宫颈癌的化疗中占有重要地位，其具体作用机制仍未完全探明。有文献报道DDP可通过ERK途径下调Stat3抑制肿瘤细胞的生长与增殖^{[3, 18]}，另有文献显示DDP可通过抑制c-Myc的表达而抑制肿瘤细胞的生长与增殖^[19-20]，而宫颈癌中DDP与Stat1的关系并无相关研究。

本研究通过DDP对Hela细胞的梯度浓度处理，发现DDP抑制Hela细胞生长与增殖的过程中显著上调了Stat1的表达，且其上调程度与DDP的处理浓度呈正相关。

本研究进一步使用靶向Stat1干扰RNA与DDP联合处理细胞，发现Stat1-siRNA可以削弱DDP对Hela细胞生长和增殖的抑制效应；另一方面，DDP可以抑制Stat1下游因子c-Myc的表达，Stat1-siRNA可削弱DDP对c-Myc的抑制作用。证明随着Stat1的下调，Hela细胞对DDP的敏感性被削弱，Stat1可增强Hela细胞对顺铂的敏感性；Stat1介导了DDP对Hela细胞的抑制效应，Stat1是宫颈癌顺铂化疗的作用新靶点。另外证明文献中报道DDP对c-Myc的抑制作用，是通过Stat1介导的。

在接受单次单药的顺铂化疗（50 mg/m²）患者中，约28~36%出现肾毒性，约31%出现耳毒性，约1/3出现血液学毒性，大部分患者胃肠道反应重^[17]。随着分子靶向药物问世，多种靶向药物已在临床上和铂类抗癌药物联合应用，并取得了不错的疗效。如盐酸厄洛替尼片（tarceva）^[21]、吉非替尼（gefitinib）^[22]与顺铂联用都可有效治疗中晚期肺癌患者，此外，还有多靶点药物索拉菲（sorafenib）等与铂类联合治疗肝癌患者^[23]，在改善化疗耐药性、提高化疗敏感性、减轻化疗副作用方面有可喜的效果。最近在T细胞淋巴瘤和卵巢癌的研究中发现Stat1可以改善肿瘤细胞对化疗药物耐药性^[5-6]，而本研究在宫颈癌Hela细胞中证明了Stat1也具有同样的作用，提示开发以Stat1为靶点的化疗协同药物有诱人的前景。

综上所述，Stat1、c-Myc介导了DDP抑制Hela细胞生长、增殖的作用；Stat1可增强Hela细胞对顺铂的敏感性。本研究补充了DDP对宫颈癌的作用靶点，揭示了宫颈癌细胞中可能存在STAT1/c-Myc通路，初步探讨了其在DDP化疗中可能的机制及作用。在宫颈癌及其他细胞株或者宫颈癌在体实验中的进一步研究，以及DDP能激活Stat1/c-Myc通路是靶向调控哪个蛋白等等，都将在本课题组后期的研究中进行进一步探讨。