血管钙化是糖尿病患者的常见并发症，能增加心血管疾病的发病率和死亡率^[1]。近年来的研究证明血管钙化是一种类似骨生成的主动调节过程，伴随着大量的骨相关蛋白如cbfa1、Osx、OCN、BMP2的表达上调^[2-3]。既往的研究表明高糖能诱导体外血管平滑肌细胞（VSMCs）钙化^[4-5]。然而，高糖诱导血管平滑肌细胞钙化的机制尚不明确。WNT信号通路是导致血管钙化的重要机制之一。已有研究报道WNT信号通路参与了血管钙化^[6-7]。但是，WNT信号在高糖诱导的血管钙化中的作用并不清楚。本研究采用体外血管平滑肌细胞钙化模型，研究高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化的WNT信号机制，探讨糖尿病患者血管钙化形成的可能机制。

细胞培养试剂、p-nitrophenylphosphate、茜素红来自Sigma公司；Dkk1购自R & D；SYBR green试剂盒购自Applied Biosystems；TRIzol试剂购自Invitrogen；AMV逆转录酶购自Roche；BCA蛋白定量试剂盒、Western blot发光试剂盒购自Pierce；抗β-catenin和phospho-β-catenin（Ser675）抗体购自Cell signaling。

动脉来源于中山大学附属第一医院截肢手术病人，采用explant方法分离血管平滑肌细胞^[8]，将动脉切成1 mm的小块，置于含10%FBS的DMEM培养液中培养，每周更换培养液3次。细胞长满后，进行传代培养。取3~6代的细胞用来实验，细胞中分别加入5 mmol/L葡萄糖（阴性对照），25 mmol/L葡萄糖和25 mmol/L甘露醇（渗透压对照），WNT信号抑制剂Dkk1（25 ng/ml），培养7 d，观察细胞钙盐沉积和骨相关蛋白的表达。

去除细胞培养液，PBS溶液洗细胞3次后，用4%的甲醛常温下固定细胞10 min，加入2%茜素红（pH 4.2）溶液染色5 min，去离子水洗涤细胞，显微镜下观察细胞染色情况并拍片。血管切片的茜红素染色：常规石蜡切片，脱蜡后水化，2%茜素红溶液染色5 min，丙酮脱水后封片拍照。采用邻甲酚酞络合剂的方法测定细胞钙离子浓度^[9]。

用PBS洗涤细胞3次后，用0.1% Triton X-100裂解细胞抽取蛋白，离心后取上清液，用BCA法测定样品的蛋白含量。然后将180 μl p-nitrophenylphosphate（pNPP）反应底物加入样品，37 ℃反应15 min，加入3 mol/L NaOH终止反应，用分光光度计于405 nm处测定溶液吸光度D值。

参照TRIzol试剂说明书，采用TRIzol提取VSMCs的总RNA。测定RNA的浓度，取1 μg RNA，加入AMV逆转录酶将mRNA反转录为cDNA，然后用SYBR green试剂盒配制成20 μl PCR反应体系，在7900 HT Fast Real-Time PCR仪上进行荧光定量PCR。以β-actin作为内参，用△△Ct的方法计算基因mRNA表达的相对量。PCR所用的引物见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 qRT-PCR引物序列 Table 1 Primer sequence for qRT-PCR Genes Forward primer Reverse primer β-actin GGACTTCGAGCAAGAGATGG AGCACTGTGTTGGCGTACAG Wnt3a ACTACGTGGAGATCATGCCC ATGAGCGTGTCACTGCAAAG Wnt7a AGAGAAGCAAGGCCAGTACC CCGTGGCACTTACATTCCAG Fzd4 GCCAATGTGCACAGAGAAGA GGTTTTGTGAGGTAAGGGCA Wisp1 CTCCAATGTTAACGCCCAGT AAGTTCATGGATGCCTCTGG Cbfa1 ACGATCTGAGATTTGTGGGC TTCCCGAGGTCCATCTACTG OCN GTAGTGAAGAGACCCAGGCG TCAGCCAACTCGTCACAGTC Osx TAATGGGCTCCTTTCACCTG CACTGGGCAGACAGTCAGAA BMP2 GCTAGACCTGTATCGCAGGC AAACTCCTCCGTGGGGATAG

表 1 qRT-PCR引物序列 Table 1 Primer sequence for qRT-PCR

收集VSMCs，用PBS洗3次后，加入细胞裂解液（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS）提取细胞总蛋白，离心后取上清，用BCA法测定样品蛋白浓度。加热蛋白变性后上样，10%SDSPAGE胶进行电泳分离总蛋白，湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜，室温下脱脂奶粉封闭1 h。加抗β-catenin抗体（1:1000）、抗phospho-β-catenin（Ser675）抗体（1:1000）室温孵育1 h，TBST洗膜3次，然后加HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后ECL发光，暗室胶片显影。

每次实验至少重复3次，计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS软件分析数据，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05被认为有差异统计学意义。

茜红素染色显示糖尿病患者（DM）的动脉血管出现明显的钙化，非糖尿病患者（NDM）的动脉未检测到钙化（图 1A）。与非糖尿病患者组比较，糖尿病患者的动脉WNT信号通路分子包括Wnt3a，Wnt7a，Fzd4，Wisp1的mRNA表达明显增加（图 1B）。

图 1(Figure 1)

图 1 钙化血管WNT信号分子的表达 Figure 1 Expression of WNT signaling molecules in calcified arteries. A: Calcification assessed by Alizarin red staining. B: Expression of WNT signaling molecules analyzed by qRT-PCR. *P < 0.05, Scale bar=100 µm.

与正常糖组（NG）比较，高糖组（HG）血管平滑肌细胞WNT信号通路分子包括Wnt3a，Wnt7a，Fzd4，Wisp1的mRNA表达明显增加，而甘露醇高渗透压对照组（OC）并没有变化（图 2A）。另外，高糖能明显地促进血管平滑肌细胞WNT信号通路关键分子β-catenin的磷酸化，激活WNT信号通路，而甘露醇并不能刺激β-catenin的磷酸化（图 2B）。

图 2(Figure 2)

图 2 高糖对血管平滑肌细胞WNT信号的影响 Figure 2 Effect of high glucose on WNT signals in vascular smooth muscle cells. A: Expression of WNT signaling molecules was analyzed by qRT-PCR. B: β-catenin expression was analyzed by Western blotting. *P < 0.05

与正常糖组比较，高糖组血管平滑肌细胞骨相关蛋白包括Cbfa1，Osx，OCN，BMP2的mRNA表达明显增加，而甘露醇没有诱导这种变化（图 3A）。另外，高糖能明显增加血管平滑肌细胞成骨样分化分子标志物ALP的活性，而甘露醇不能提高ALP的活性（图 3B）。

图 3(Figure 3)

图 3 高糖对血管平滑肌细胞成骨样分化的影响 Figure 3 Effect of high glucose on osteogenic differentiation of vascular smooth muscle cells. A: Expression of bone-related proteins analyzed by qRT-PCR. B: ALP activity assessment. *P < 0.01.

为了研究WNT信号在高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化的作用，我们观察了WNT信号抑制剂Dkk1对高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化的作用。茜红素染色显示Dkk1处理血管平滑肌细胞7 d后，高糖诱导的钙化明显减轻（图 4A）。与对照组比较，Dkk1组细胞的钙离子浓度明显降低（图 4B）。

图 4(Figure 4)

图 4 Dkk1对高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响 Figure 4 Effect of Dkk1 on vascular smooth muscle cell calcification induced by high glucose. A: Calcification assessed by Alizarin red staining. B: Quantitative analysis of calcium content. *P < 0.01 vs control. Scale bar=100 µm.

我们还观察了Dkk1对高糖诱导的血管平滑肌细胞骨相关蛋白表达的影响。与对照组比较，Dkk1组血管平滑肌细胞骨相关蛋白包括Cbfa1，Osx，OCN，BMP2的mRNA表达明显下降（图 5A）。此外，Dkk1能明显降低血管平滑肌细胞ALP的活性（图 5B）。

图 5(Figure 5)

图 5 Dkk1对血管平滑肌细胞成骨样分化的影响 Figure 5 Effect of Dkk1 on osteogenic differentiation of vascular smooth muscle cell induced by high glucose. A: Expression of bone-related proteins analyzed by qRTPCR. B: ALP activity assessment. *P < 0.01 vs control.

血管钙化是一种受基因调节的主动过程，与骨生成的过程类似。血管平滑肌细胞是参与血管钙化的主要细胞来源^[10]。当血管平滑肌细胞受到氧化应激、高糖等刺激因素的作用后，可分化成为成骨样细胞，分泌大量的骨相关蛋白如ALP、cbfa1、OCN和BMP2等，从而诱导细胞钙化^[11-12]。本研究发现：高糖能促进血管平滑肌细胞钙化，上调骨相关蛋白Cbfa1、Osx、OCN和BMP2的表达和增加成骨样分化分子标志物ALP的活性。此外，我们还发现：高糖激活血管平滑肌细胞Wnt信号通路，而使用Wnt信号通路Dkk1抑制剂明显减弱高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化和成骨样分化，提示Wnt信号通路参与了高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化。

已有研究证明高糖参与了血管钙化过程。相较于非糖尿病患者，糖尿病患者的动脉钙化明显增加，钙相关蛋白的表达上调^[12]。此外，体外实验证明：高糖能增加骨相关蛋白cbfa1、OCN、BMP2的表达，提高ALP的活性，促进VSMC钙化^[12-13]，但其导致血管钙化的机制不明确。我们的研究也发现高糖能明显上调骨相关蛋白包括Cbfa1、Osx、OCN、BMP2的表达，促进人的血管平滑肌细胞钙化。另外，糖尿病患者的动脉WNT信号通路分子包括Wnt3a、Wnt7a、Fzd4、Wisp1的mRNA表达明显增加。体外实验证明：高糖能上调血管平滑肌细胞Wnt3a、Wnt7a、Fzd4、Wisp1的mRNA表达，明显地促进血管平滑肌细胞WNT信号通路关键分子β-catenin的磷酸化，提示高糖诱导的血管钙化可能与WNT信号通路有关。

WNT蛋白家族是进化上高度保守的分泌型糖蛋白，在胚胎发育过程中调节细胞的增殖和分化。WNT信号异常可导致肿瘤，骨质疏松，糖尿病等疾病。经典WNT信号通路通过WNT配体结合其受体Frizzled（FZD）和Receptor-related proteins 5 and 6（LRP5 and LRP6），形成WNT-FZD-LRP复合物，稳定关键分子β-catenin，进入细胞核与T cell factor/lymphoid enhancer factor（TCF/LEF）形成复合物，激活下游靶基因的表达^[13]。体外实验证明：WNT/β-catenin信号通路参与了血管平滑肌细胞钙化^[14-15]。我们的研究发现WNT信号通路抑制剂Dkk1能明显抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化。此外，Dkk1能降低血管平滑肌细胞ALP的活性和下调骨相关蛋白Cbfa1、Osx、OCN和BMP2的表达。综上所述，我们的研究表明：高糖刺激血管平滑肌细胞，激活WNT信号通路，上调骨相关蛋白Cbfa1、Osx、OCN和BMP2的表达，从而诱导血管平滑肌细胞出现成骨样分化，最终导致血管平滑肌细胞钙化。因此，WNT信号通路是介导高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化的重要机制，可能成为干预糖尿病患者血管钙化的有效靶点。