脑卒中具有高发病率、高致残率、高致死率和高复发率的特点，目前已成为人类致残和死亡的重要原因之一，也是我国国民第1位的死亡原因，死亡率高于欧美国家的4~5倍。脑血管病给社会和家庭带来了沉重的经济负担，但对于脑血管病造成的中枢神经系统损伤仍缺乏有效的治疗，因此，积极寻求神经保护剂是目前研究的首要任务。

米诺环素是一种半合成的高脂溶性四环素类抗生素，能有效地通过血脑屏障。近年来的研究表明米诺环素是目前最有前途的神经保护剂，具有抑制小胶质细胞的激活、半胱天冬酶-1依赖的细胞凋亡及抗氧化应激等药理作用。最近一项临床研究表明，米诺环素能促进急性缺血性卒中患者神经功能的恢复^[1]。血红素加氧酶-1（HO-1）是机体最重要的内源性保护体系之一，上调HO-1蛋白的表达可缓解缺血性脑损伤^[2]。PC12细胞被广泛应用于模拟体外神经元损伤的研究。本课题组前期的研究表明，米诺环素可减轻缺氧缺糖损伤所致PC12细胞的损伤，并上调HO-1基因及蛋白的表达，但其机制仍不明确。

本研究通过体外培养PC12细胞，建立氧糖剥夺（OGD）损伤模型模拟在体脑缺血，观察米诺环素对PC12细胞OGD损伤的保护作用，并进一步探讨其保护作用是否通过诱导胞外信号调节蛋白激酶1/2（ERK1/ 2）信号通路上调PC12细胞中HO-1的表达。

高分化PC12细胞株购于中国科学院上海细胞库。三气培养箱（美国Thermo公司）。DMEM培养基、胎牛血清、DMEM无糖培养基（美国Gibico公司）。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、盐酸米诺环素购自Sigma公司。抗HO-1多克隆抗体（Santa Cruz公司）；兔抗p-ERK1/2抗体、兔抗ERK1/2抗体及兔抗GAPDH抗体（美国CST公司）；鼠抗β-actin多克隆抗体（北京四正柏公司）；磷酸化蛋白及全蛋白提取试剂盒（南京凯基生物公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒及MEK抑制剂U0126购于碧云天生物技术研究所。

PC12细胞用DMEM完全培养基（含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/L链霉素），置于37 ℃、5% CO₂及饱和湿度的孵箱中常规培养。隔天换液，待细胞铺满瓶底80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3传代，收获第5~8代PC12细胞用于以下实验。取处于对数生长期的PC12细胞以2×10⁵/ml，每孔100 μl接种在96孔板用于MTT实验，以1×10⁶/ml密度接种于75 cm²培养瓶（Western blotting检测）。细胞随机分为4组：正常对照（Normal）组、缺氧缺糖（OGD）组、米诺环素治疗（MC）组和MEK1/2抑制剂（U0126）组。米诺环素在细胞缺氧的同时加入，U0126 (10 μmol/L)在缺氧前60 min加入。

参照并改进Singh等^[3]报道的PC12细胞氧糖剥夺模型。当细胞培养12 h后，用PBS清洗3遍，换用无血清无糖DMEM培养基，并将细胞置于含5% CO₂、94% N₂、1% O₂、37 ℃的三气培养箱中分别培养6 h，然后换成无血清的DMEM培养液，置于正常培养环境继续培养24 h模拟再灌注。正常对照组加入DMEM完全培养基，置于常规培养箱培养。不同浓度的米诺环素（0.1、1、10 μmol/L）在OGD及再灌注的全过程加入。

复氧24 h后，96孔板细胞加入10 μl/孔MTT溶液（5 mg/ml），置于培养箱继续孵育4 h，轻轻吸弃培养液，每孔加入100 μl DMSO，置于摇床上振荡10 min。待结晶完全溶解后，用酶标仪测定各孔在570 nm波长处的吸光度值，每组6孔，重复3次实验。以正常对照组MTT吸光值为基数100%，模型组及药物干预组细胞存活率按公式计算：细胞存活率（%）=（D₅₇₀处理组平均值/ D₅₇₀正常对照组平均值）×100%。

复氧24 h后，按照全蛋白提取试剂盒说明书以每2×10⁶个细胞加入100 μl裂解液，冰上振荡及离心后，收集上清置于EP管并用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。以20 μg蛋白/样品上样，10%变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，转膜及封闭后加入特异性一抗HO-1、p-ERK1/2、ERK1/2，β-actin及GAPDH抗体4 ℃孵育过夜，二抗孵育1.5 h后，在Bio-Rad凝胶扫描成像系统显影拍照。使用Quantity One图像分析软件测定各条带的光密度积分值（OD值），目的条带与内参光密度的比值作为该蛋白表达的相对含量。

采用SPSS 17.0软件包对各组数据进行统计学处理。计量资料以平均数±标准差表示，各组间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05，P < 0.05表示差异有统计学意义。

MTT结果显示，OGD 6 h造成PC12细胞严重损害，细胞存活率（47.9±1.4）明显低正常对照组（100%，P < 0.01），米诺环素（0.1、1、10 μmol/L）能缓解OGD损伤造成PC12细胞存活率的下降（71.4±2.9 vs 77.5±1.8vs56.3±2.3），与模型组比较均有统计学意义（P < 0.05），其中1 μmol/L保护作用最明显。

Western blotting检测结果显示，正常对照组PC12细胞HO-1蛋白仅有少量表达（0.31±0.07），OGD 6 h复氧后PC12细胞HO-1蛋白（0.99±0.08）表达明显高于正常对照组（P < 0.05），0.1、1、10 μmol/L米诺环素处理PC12细胞后HO-1蛋白含量分别为1.33±0.12、1.71±0.05和0.84±0.05，呈浓度依赖性逐渐增加（图 1）。为保证结果的稳定性，我们选取最佳浓度1 μmol/L米诺环素进行后续研究。

图 1(Figure 1)

图 1 米诺环素对PC12细胞OGD损伤后HO-1蛋白表达的影响 Figure 1 Effects of minocycline on HO-1 protein expression in PC12 cells after OGD injury. ﹟P < 0.05 vs normal group; ★★P < 0.05 vs OGD group.

本研究进一步观察ERK信号通路是否参与米诺环素对PC12细胞OGD损伤后的保护作用。Western blotting结果显示，各组间总ERK1/2蛋白的表达差异无统计学意义。正常对照组p-ERK1/2蛋白仅有少量表达，OGD组ERK1/2蛋白磷酸化水平较正常组有轻度增加，但差异无统计学意义（P > 0.05）。同OGD组（1.55±0.16）比较，1 μmol/L米诺环素（7.19±0.84）处理可明显增加ERK1/2的磷酸化水平（P < 0.01），U0126（10 μmol/L）能有效抑制p-ERK1/2的表达（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 米诺环素对PC12细胞OGD损伤后p-ERK1/2蛋白表达的影响 Figure 2 Effects of minocycline on p-ERK1/2 protein expression in PC12 cells after OGD injury. ★ ★P < 0.05 vs OGD group; ▲P < 0.05 vs MC group.

本研究进一步探讨ERK1/2信号通路是否参与米诺环素对OGD损伤后PC12细胞HO-1蛋白表达的调控，米诺环素（1 μmol/L）可引起OGD损伤后PC12细胞HO-1蛋白的表达明显升高（P < 0.05），预加U0126干预后，能抵消米诺环素诱导OGD后PC12细胞HO-1表达的上调（P < 0.05），而单独给予U0126预处理后，HO-1的表达无明显变化（P > 0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 ERK1/2抑制剂对OGD损伤后PC12细胞HO-1蛋白表达的影响 Figure 3 Effects of ERK1/2 inhibitor on HO-1 protein expression in PC12 cells after OGD injury.

本研究首先证实米诺环素可使OGD损伤后的PC12细胞存活率升高，促进血红素加氧酶-1蛋白表达的增加，进一步研究发现米诺环素诱导OGD损伤后PC12细胞HO-1蛋白表达增加是通过调节ERK1/2信号通路实现。目前的研究表明具有抗氧化活性的HO-1蛋白在缺血再灌注损伤病理过程中发挥着重要的作用^[4]。因此，上调HO-1蛋白的表达可能是潜在缺血性脑损伤的治疗新策略。

以前的研究表明米诺环素在体外OGD损伤模型中具有保护作用^[5-6]。米诺环素能下调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）并上调内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达，对慢性脑缺血引起的氧化应激损伤具有抑制作用^[7]。HO-1是一种重要的内源性抗氧化应激蛋白。Wang等^[8]研究表明米诺环素能调节HO-1的表达，减轻急性肝衰竭大鼠氧化应激反应造成的脑损伤。前期研究证实缺血性脑损伤后大鼠脑组织内HO-1的表达明显增加，从而增加脑组织对缺氧的耐受性，抵抗进一步的缺血再灌注损伤^[9-10]。首先本研究发现氧糖剥夺后PC12细胞HO-1表达显著增加与前期报道相吻合，提示氧糖剥夺诱导HO-1表达的上调可能是细胞对氧化应激损伤的适应过程。其次本研究观察到米诺环素能提高氧糖剥夺后PC12细胞的存活率，同前期研究结果一致^[5]。HO-1基因的转录和表达与细胞外信号调节激酶信号通路的激活有关^[11]。脑缺血损伤后，ERK1/2信号通路介导神经元的死亡和存活^[6]。许多神经保护剂发挥抗炎、抗氧化应激的作用是通过激活ERK1/2信号通路实现的。Chen等^[12]采用原代培养的神经元研究发现，OGD损伤后ERK1/2的磷酸化水平呈动态变化过程，缺氧3 h开始上升一直维持到缺氧12 h。本研究表明PC12细胞OGD损伤/复氧24 h后，ERK1/2的磷酸化水平无明显变化，但PC12氧糖剥夺损伤后米诺环素能激活ERK1/2信号通路，使ERK1/2磷酸化水平增加并上调HO-1的表达，预先加用ERK1/2上游激酶MEK1/2特异性抑制剂U0126可显著抑制HO-1表达的增加。综上，ERK1/2信号通路介导米诺环素诱导OGD损伤后PC12细胞表达HO-1，但本研究尚不能证明OGD损伤后ERK1/2信号通路是否参与HO-1蛋白的表达，而且米诺环素调节ERK1/2磷酸化的机制需进一步研究。米诺环素因具有直接的抗氧化活性，在多种中枢神经系统疾病模型中发挥神经保护作用。因此，米诺环素诱导HO-1的表达和抑制OGD诱导PC12细胞的死亡可能与由其抗氧化活性有关。需要进一步在体内验证这一观点。

综上所述，本研究首先通过体外培养PC12细胞，建立脑缺血再灌注损伤的细胞模型，证明米诺环素对OGD损伤的PC12细胞具有保护作用，其机制可能是通过激活ERK1/2信号通路从而上调抗氧化蛋白HO-1的表达有关。然而，米诺环素的神经保护作用有待动物模型进一步验证。