三甲基锡（trimethyltin, TMT）是生产塑料稳定剂中伴生的一种副产物，广泛存在于生产和生活中。工业上，TMT主要存在于油漆、塑料等行业；农业上，TMT主要存在于杀虫剂、灭菌剂等。TMT可通过皮肤、黏膜、呼吸道、消化道等途径进入人体，并与血红蛋白有高度亲和力^[1]，它可以选择性作用于包括海马在内的边缘系统，其中造成神经系统损伤最突出的表现为学习记忆功能障碍^[2]。突触囊泡蛋白（synaptophysin, SYP）是位于突触小泡表面及突触前膜含量丰富的膜蛋白^[3]，其结构含有缝隙样链接，参与包括单胺类、氨基酸类、胆碱能等多种神经递质的释放过程，并可调节突触可塑性^[4]；因此，SYP与学习记忆功能密切相关^[5]，但鲜见SYP蛋白表达在TMT致学习记忆功能障碍中的作用研究。芦丁是一种黄酮类化合物，它具有抗炎，抗氧化，清除自由基等生物学活性。文献报道，芦丁可改善TMT致学习记忆功能障碍模型小鼠的空间记忆能力^[6]。本文旨在探讨芦丁预处理对TMT致小鼠学习记忆功能障碍的保护作用及可能机制，为TMT的防治提供参考。

三甲基锡（TMT货号：146498，美国Sigma）；突触囊泡蛋白（SYP Ⅰ抗，货号：ab8049，美国Abcam）；β-actinⅠ抗（货号：A2228，美国Sigma）；IRDye 800CW驴抗小鼠荧光抗体（绿鼠Ⅱ抗，货号：926-32212，美国LI-COR）等。

Morris水迷宫视频跟踪系统（MT-200，中国成都泰盟）；多功能酶标仪（Infinite M200，瑞士Tecan）；Odyssey红外荧光6扫描成像系统（9120，美国LI-COR）等。

SPF级6~9周龄雄性BALB/c小鼠（第三军医大学实验动物中心提供，生产许可证：SYXK (渝) 2012-0002）。动物饲养温度：21±2 ℃，室内光照12 h（光照时间08:00~20:00），动物进食标准基础饲料，自由饮水。实验开始前于实验室适应性喂养1周。随机分为生理盐水（对照组）、TMT组、TMT+芦丁组、芦丁组，每组各10只，共40只。TMT的剂量参考文献[7]并通过预实验确定为2.25 mg/kg，1次性给药；后两组芦丁预处理1周（1次/d），芦丁的剂量参考相关文献为10 mg/kg ^[6]，各组均腹腔注射给药。

Morris水迷宫参照文献[7-8]略改：直径120 cm，平台直径10 cm，水温保持24~26 ℃，用奶粉使水变得不透明，平台放在任意象限中央（与内环和外环相切）并在水下1~2 cm。按照小鼠的生活习性，水迷宫测试的时间在16:00~20:00进行。将小鼠放入水迷宫时，小鼠的头朝向水迷宫壁，4个象限的任意一个入水点均可。水迷宫实验前1 d让小鼠在水迷宫中（无平台）自由游1 min/次，共10次，以熟悉水迷宫环境。小鼠最大逃逸潜伏期为60 s，如果在60 s内小鼠没找到并爬上平台，则由实验员用小木棍引领并将其带上平台，并记录时间为60 s，否则记录相应时间x s，每次让小鼠在平台上待15 s。每只小鼠训练的时间间隔为15 min，1 d完成训练共8次^[7]，每1次实验结束时将小鼠身上的水擦干并让其在取暖器旁取暖。

参考文献[9]的方法略改：水迷宫实验后，断头处死小鼠，在冰上快速取出海马脑组织，提取总蛋白并测其浓度；经10% SDS-PAGE，80 V恒压分离，用湿转系统将目标蛋白转至NC膜上，电转150 mA；转印结束后，用5%脱脂奶粉封闭1 h；用TBST洗膜5 min×1次，孵育SYPⅠ抗（1:1000）置于脱色摇床4 ℃过夜；次日，TBST洗膜5 min×4次，绿鼠Ⅱ抗（1: 5000）室温下避光孵育1 h，TBST洗膜5 min×4次；β-actinⅠ抗体室温1 h，TBST洗膜5 min×4次，绿鼠Ⅱ抗室温1 h，TBST洗膜5 min×4次，Odyssey红外荧光扫描成像系统软件对目标条带荧光光密度比较分析。

采用SPSS18.0统计软件分析数据，计量资料用均数±标准差表示，Morris水迷宫实验逃逸潜伏期和Western blot的结果先行方差齐性检验，组间比较行单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较用SNK法，P < 0.05为差异有统计学意义。

BALB/c小鼠TMT（2.25 mg/kg）腹腔注射后24 h，TMT组进食与饮水量较对照组和芦丁组及TMT+芦丁组减少，身体有轻微的振颤，头部为最；TMT组活动量较其余3组减少，喜欢成对或成团聚集在一起；TMT组小鼠易被激怒，尾部有少许咬痕等。对照组和芦丁组及TMT+芦丁组进食、饮水量及活动量等表现类似，无明显异常表现。

TMT（2.25 mg/kg）腹腔注射后24 h，从水迷宫测试的逃逸潜伏期看（图 1），连续8次水迷宫训练，经方差齐性检验，各组总体方差齐同，行单因素方差分析，组间差异有统计学意义（F=8.625，P < 0.01）；SNK法比较结果显示：与TMT组相比，生理盐水组（对照）及芦丁组小鼠逃逸潜伏期从水迷宫训练第4次起显著缩短（P < 0.05）；与TMT组相比，TMT+芦丁组小鼠逃逸潜伏期从水迷宫训练第5次起显著缩短（P < 0.05）；与对照组和芦丁组相比，TMT+芦丁组小鼠逃逸潜伏期差异无统计学意义（P > 0.05）。从搜索平台的策略上看（图 2），TMT组小鼠在水迷宫边缘区域用时较多（外环用时平均占总收索时间的88.91%，中环+内环用时平均占11.9%），主要表现为边缘式；对照组和芦丁组小鼠经水迷宫训练第4次以后搜索平台时多在水迷宫中央区域（外环用时平均占总收索时间为39.10%和36.23%，中环+内环用时平均占60.9%和63.77%），主要表现为趋近式，而TMT+芦丁组小鼠在水迷宫训练到第5次后表现与对照组和芦丁组的搜索方式类似（外环用时平均占总收索时间为43.42%，中环+内环用时平均占56.58%）。

图 1(Figure 1)

图 1 各组连续8次水迷宫训练逃逸潜伏期的结果 Figure 1 Changes in escape latency in each group in consecutive 8 Morris water maze test. TMT groups vs TMT + Rutin groups, *P < 0.05, **P < 0.01; TMT groups vs Saline group, @ < 0.05, @@ < 0.01; TMT groups vs Rutin group, #P < 0.05, ##P < 0.01.

图 2(Figure 2)

图 2 各组水迷宫训练第8次的轨迹图 Figure 2 Trace diagram in each group in the 8th Morris water maze test.

TMT（2.25 mg/kg）腹腔注射后24 h，各组海马和皮层SYP蛋白表达情况（图 3，4）。由表 1可知，经方差齐性检验，各组总体方差齐同；行单因素方差分析显示，组间差异有统计学意义（F=92.168，P < 0.001）。SNK法结果显示：TMT组小鼠海马和皮层脑区SYP蛋白表达较对照组和芦丁组明显降低（P < 0.05）；与TMT组相比，TMT+芦丁组小鼠海马和皮层脑区SYP蛋白表达显著增加（P < 0.05）；与对照组及芦丁组相比，TMT+芦丁组小鼠海马和皮层脑区SYP蛋白表达差异无统计学意义（P > 0.05）。

图 3(Figure 3)

图 3 Western blot检测各组海马脑区SYP蛋白表达的情况 Figure 3 Expression of synaptophysin protein in the hippocampus in each group detected by Western blotting.

图 4(Figure 4)

图 4 Western blot检测各组皮层脑区SYP蛋白表达的情况 Figure 4 Expression of synaptophysin protein in the cortex in each group detected by Western blotting.

表 1(Table 1)

表 1 Western blot检测各组海马和皮层到SYP蛋白表达 Table 1 Synaptophysin expression in the hippocampus and cortex in each group detected by Western blotting (n=6) Group SYP/β-actin Hippocampus Cortex Saline 0.985±0.086 0.989±0.092 Rutin 0.996±0.062 0.991±0.081 TMT 0.625±0.126* 0.582±0.118* TMT+Rutin 0.972±0.098 0.986±0.076 *P < 0.05 vs saline group.

表 1 Western blot检测各组海马和皮层到SYP蛋白表达 Table 1 Synaptophysin expression in the hippocampus and cortex in each group detected by Western blotting (n=6)

随着科技的迅猛发展，人们环保意识不断增强，无铅塑料稳定剂逐渐退出市场，含锡稳定剂透明效果及稳定性较好，其占市场份额越来越大。但生产含锡稳定剂如二甲基锡、三乙基锡等过程中会产生一种副产物即TMT。1978年，两位化学家因暴露TMT与DMT的混合物后，表现出一系列中枢神经系统中毒症状^[10]；以及在生活中不断发生TMT中毒事件，多为急性中毒，并且目前还没有针对TMT中毒的特效解毒剂，从而引起学者们的广泛关注^[11]。当前，有人认为TMT可能与神经退行性疾病发生有关^[12]。神经退行性疾病突出的表现为学习记忆功能障碍，其确切机制尚未明了。因此，本研究建立急性TMT暴露模型，探讨TMT致学习记忆功能的影响及与学习记忆功能密切相关的SYP蛋白表达情况，并研究芦丁预处理后TMT致小鼠学习记忆功能的影响及SYP蛋白的表达情况，从行为学及分子生物学层面探讨TMT致学习记忆功能障碍的可能机制，为TMT中毒的有效防治提供科学依据。

小鼠TMT（2.25 mg/kg）暴露后24 h，其行为方面表现出有轻微的神经中毒症状，这与前期报道一致^{[1, 7]}，而芦丁预处理1周后再给予TMT，小鼠无明显异常表现，提示芦丁预处理可能有预防作用。水迷宫试验作为公认的行为学评价工具，广泛应用于行为、认知功能等方面的研究，因研究对象及建立模型的差异，其训练方式也有所不同。文献报道TMT暴露后其逃逸潜伏期在168 h内可恢复至正常，但其组织损伤尚未修复，因此本研究参考文献在1 d内完成水迷宫测试^[7]。经水迷宫测试，TMT组小鼠较对照组小鼠逃逸潜伏期显著延长，并且其搜索策略为边缘式，而TMT+芦丁组和对照组及芦丁组小鼠在水迷宫训练第5次后表现类似，搜索策略为趋近式，这提示TMT急性暴露已导致小鼠学习记忆功能障碍。TMT+芦丁组较TMT组小鼠水迷宫逃逸潜伏期显著缩短，搜索策略也更为科学；TMT+芦丁组与对照组及芦丁组相比，其逃逸潜伏期差异无统计学意义，搜索策略类似，这提示芦丁预处理对TMT致小鼠学习记忆功能障碍有改善作用，这与文献[6]一致。

小鼠TMT（2.25 mg/kg）暴露后24 h，Western结果显示TMT组小鼠海马和皮层脑区SYP蛋白表达较对照组显著降低；结合水迷宫测试，TMT组小鼠逃逸潜伏期较对照组显著延长。芦丁预处理1周再给予TMT，结果提示芦丁预处理可拮抗TMT致小鼠海马和皮层脑区SYP蛋白表达降低；TMT+芦丁组小鼠较对照组和芦丁组小鼠海马和皮层脑区SYP蛋白表达略为降低，但差异无统计学意义；经水迷宫测试，芦丁预处理可改善TMT致小鼠逃逸潜伏期显著延长的情况，并且与对照组及芦丁组小鼠逃逸潜伏期差异无统计学意义，这提示芦丁对TMT致小鼠学习记忆功能障碍的保护作用与拮抗海马和皮层脑区SYP蛋白表达下调有关。文献报道SYP广泛表达于突触前膜和突触小泡^[13]，因其特殊结构，可通过胞吞或胞吐等方式参与神经递质的释放过程^[14]，并可调节突触可塑性^[4]；因此，SYP表达含量变化与学习记忆功能密切相关^[15-16]。目前，关于TMT导致学习记忆功能障碍发生的机制研究主要有凋亡、炎性反应、氧化损伤、钙离子通道、神经递质释放^[17-19]等，涉及多条信号通路^[20]，但TMT是如何导致海马和皮层等脑区SYP蛋白含量降低，而引起学习记忆功能障碍的发生，其确切机制有待进一步研究。