脂肪前体细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化的特异化前体细胞。因为具有脂肪细胞的分化能力而被广泛应用于糖、脂代谢相关的基础和实验研究，应用脂肪前体细胞建立的体外IR模型已被广泛应用于胰岛素增敏剂药物作用的评价和研究。国外已建立了来源于小鼠的前体脂肪细胞株，如3T3-L1，3T3-F442A，ob17等系列，并已应用于医学研究的各个领域。其中3T3-L1细胞株的应用最为广泛。3T3-L1前体脂肪细胞分裂自Swiss小鼠的脂肪纤维细胞，3T3-L1前体脂肪细胞是由Green和Kehinde分离克隆的，在细胞融合成单层的情况下具有自发的分化为成熟脂肪细胞的能力，但这种分化方式效率很低，且耗时。国内外研究多采用1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine, IBMX）、地塞米松（dexamethason, DEX）、胰岛素共同作用来进行诱导分化^[1-3]。但是，到底使用多大浓度的胰岛素？不同的文献有不同的报道。诱导的时间是多少？诱导成功后的脂肪胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）细胞稳定性怎么样？国内外文献并未见详细报道。基于此，本实验着重考察了3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成脂肪细胞各个不同因素，以及将3T3-L1脂肪细胞诱导成胰岛素抵抗脂肪细胞的最佳胰岛素浓度、诱导时间和IR-3T3-L1细胞稳定时间，摸索出该模型的最佳诱导条件。

3T3-L1前脂肪细胞株（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）。

TRUE-100纯水仪（上海菲特科学器材有限公司，序列号：081230-62）、CO₂细胞培养箱（HEPA CLASS 100）、倒置相差显微镜（IX 71，Olympus）、SIM-F140AY65 SANYO制冰机（日本三洋）、-80 ℃超低温冰箱（Forma-86 C，美国Thermo）、METTLER TOLEDO MS105型电子精密天平[梅特勒-拖利多仪器（上海）有限公司]、IX71SF-2倒置显微镜（Olympus）等。

IBMX、DEX、Oil red O及牛胰岛素购自Sigma，DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶及新生牛血清购自GIBCO，青链霉素混合液（中国杭州四季青）、葡萄糖氧化酶法-过氧化物酶法测定试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）、无水乙醇、甲醛、异丙醇、NaHCO₃、NaOH、HCl等均购自中国医药集团上海化学试剂公司。

将存放于液氮中的细胞取出快速放入37 ℃水浴锅内解冻，将冻存管内地细胞吸出放入离心管中离心（1000 r·min^-1）5 min，弃去上清液后将3T3-L1前脂肪细胞放于10% FBS的高糖DMEM细胞维持培养基中，于37 ℃，5% CO₂培养箱培养，隔天再更换新的培养基，以利于细胞生长。3T3-L1前脂肪细胞株以倒置显微镜观察，当细胞长满为培养皿的80%左右时，可进行传代培养，在超净台内，吸去上层培养基，以4 ml PBS洗两次，吸去PBS并加入1 ml胰蛋白酶，前后左右轻晃，以使胰蛋白酶均匀分散于细胞层，置于培养箱中约2~3 min后，细胞层脱落并浮起时，加入2 ml含有10% FBS的高糖DMEM培养基以终止胰蛋白酶反应，再加入3 ml PBS微微冲洗多次，以冲散细胞后吸入无菌离心管，经800 r·min^-1，离心3 min后弃去上层液。

将悬浮的细胞计数，以1×10⁶ ml^-1培养于24孔板（DMEM细胞维持培养基），待细胞长满后再继续培养2天，更换培养基为含有不同浓度胰岛素的分化起始培养基（Group 1: DMEM+10% FBS+1 μmol·L^-1 DEX +0.5 mmol·L^-1 IBMX+10^-8 mol·L^-1 Insulin; Group 2: DMEM + 10% FBS + 1 μmol·L^-1 DEX + 0.5 mmol·L^-1 IBMX + 10^-7 mol·L^-1 Insulin; Group 3: DMEM + 10% FBS+1 μmol·L^-1 DEX+0.5 mmol·L^-1 IBMX+10^-6 mol·L^-1 Insulin) 2 ml做分化诱导，并记为分化第0天。诱导分化2 d后，更换培养基为含有胰岛素分化培养基（Group 1: DMEM + 10% FBS + 10^-8 mol·L^-1 Insulin; Group 2: DMEM + 10% FBS + 10^-7 mol · L^-1 Insulin; Group 3: DMEM+10% FBS+10^-6 mol·L^-1 Insulin），培养于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中（表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 3T3-L1细胞分组 Table 1 3T3-L1 differentiation-inducing process Days Groups DMEM+10% FBS DEX (1 μmol·L-1) IBMX (0.5 mmol·L-1) Insulin (mol·L-1) A day -2-0) Control + - - - Group 1 + - - - Group 2 + - - - Group 3 + - - - B (day 0-2) Control + + + 0 Group 1 + + + 10-8 Group 2 + + + 10-7 Group 3 + + + 10-6 C (day 2-9) Control + - - 0 Group 1 + - - 10-8 Group 2 + - - 10-7 Group 3 + - - 10-6 +: Added; ─: Not added. A: Passage cells cultured for 2 days (day -2-0). B: Cells began to receive differentiation-inducing treatment (day 0-2). With DMEM+10% FBS+DEX+IBMX as the culture medium, the control cells were not exposed to insulin and the cells in Groups 1-3 were exposed to 10-8-10-6 mol·L-1 insulin; C: Cell differentiation induction for 2-9 days. With DMEM + 10% FBS as the culture medium, the control cells were not exposed to insulin and the cells in Groups 1-3 were exposed to 10-8-10-6 mol·L-1 insulin.

表 1 3T3-L1细胞分组 Table 1 3T3-L1 differentiation-inducing process

每3 d更换培养基1次。分别取分化第3、6、9天的细胞，以Oil Red O染色以鉴定3T3-L1分化程度，观察在何种胰岛素浓度下，3T3-L1有最佳的分化条件。

为了确认前脂肪细胞是否已经成功诱导成脂肪细胞，且诱导率是多少，需要利用Oil Red O对其进行染色确认。参考文献[4-5]，按如下步骤进行：吸去3T3-L1脂肪细胞培养基→以PBS清洗培养皿2次→加入甲醛固定液→静置10 min→到去甲醛固定液→以清水清洗1次→加入100% propylene glycol→静置2 min→到去100% propylene glycol→加入Oil Red O染料→染色10 min→到去Oil Red O染料→加入100% propylene glycol→1 min→到去100% propylene glycol，去除多余的染料→清水轻轻润洗3次→苏木精染料→染色2 min→水洗5 min→显微镜下观察，拍照。

参考文献[6-8]，将分化成功的3T3-L1脂肪细胞接种入24孔板，分为对照组（control）和模型组（10^-6 mol·L^-1 insulin），对照组加正常培养基，模型组加入含1 μmol·L^-1 DEX的培养基，用GOD-POD法检测24、48、72、96、120 h培养基上清液中的葡萄糖量，选择正常组和模型组细胞葡萄糖消耗最大的时间为诱导最佳时间。实验重复3次。

将建立好的IR-3T3-L1细胞（模型组）和分化好的3T3-L1细胞（对照组）同时加入正常培养基中（不含DEX），用用GOD-POD法检测24、36、48 h培养基上清液中的葡萄糖量，观察IR-3T3-L1细胞的稳定性。实验重复3次。

实验数据采用均数±标准差表示，多组比较分析采用单因素方差分析，所有数据处理均采用GraphPad Prism version 6.01软件（GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA），P < 0.05表示差异有统计学意义，P < 0.01表示差异有显著性意义。

3T3-L1分化为脂肪细胞条件为DMEM培养基中添加1 μmol·L^-1 DEX，0.5 mmol·L^-1 IBMX及胰岛素。由于不同文献使用胰岛素的浓度各不相同，从不加胰岛素到加1.7×10^-7 mol·L^-1再到添加1.7×10^-8 mol·L^-1，使用范围相差极大。故本实验需要探索胰岛素对脂肪细胞分化的影响。

实验发现，3T3-L1细胞从液氮中的冻存状态复苏后，培养需要传代3次，才能够有良好的增殖速率，每次传代以1:3的比例移植到新皿中，3 d长满80%。3T3-L1前脂肪细胞在诱导前，细胞与成纤维母细胞相似，细胞呈现典型的不规则扁梭形，胞浆中未见脂滴（图 1A），诱导后细胞形态变圆，胞浆亮，脂滴丰富，形成“戒环样”结构，即为典型的成熟脂肪细胞（图 1B）。

图 1(Figure 1)

图 1 3T3-L1分化前后形态学变化 Figure 1 Morphology of 3T3-L1 cells before and after induced differentiation. A: Untreated; B: After induction, lipid drops formed in the cells (arrow) (Original magnification: ×200).

添加10^-8 mol·L^-1、10^-7 mol·L^-1、10^-6 mol·L^-1的胰岛素在3T3-L1前脂肪细胞的培养基中，刺激分化3 d，以Oil Red O染色发现油脂堆积不明显（图 2A~C）；从第6天开始，发现10^-6 mol·L^-1胰岛素的分化处理下，相较10^-8 mol·L^-1、10^-7 mol·L^-1胰岛素处理组有较佳的分化效果（图 2D~F）。分化处理9日后，不同浓度胰岛素的分化效果有明显区别，分化条件在10^-6 mol·L^-1胰岛素之下，细胞90%以上转化为脂肪细胞，具有最好的分化效果（图 2G~I），所以在以后的实验中，以3T3-L1脂肪细胞为实验材料时，胰岛素以10^-6 mol·L^-1浓度作为分化条件。

图 2(Figure 2)

图 2 不同浓度胰岛素情况下3T3-L1脂肪细胞分化培养 Figure 2 Effect of insulin on 3T3-L1 preadipocyte differentiation (Original magnification: ×200). 3T3-L1 preadipocytes were induced to differentiation medium with (A) 10-8 mol·L-1 insulin, 3 d; (B) 10-7 mol·L-1 insulin, 3 d; (C) 10-6 mol·L-1 insulin, 3 d; (D) 10-8 mol·L-1 insulin, 6 d; (E) 10-7 mol·L-1 insulin, 6 d; (F) 10-6 mol·L-1 insulin, 6 d; (G) 10-8 mol·L-1 insulin, 9 d; (H) 10-7 mol·L-1 insulin, 9 d and (I) 10-6 mol·L-1 insulin, 9 d. Cells were induced to differentiate for 3 days and stained with Oil red O.

图 3所示，分化好的3T3-L1细胞在1 μmol·L^-1 DEX条件下培养24~96 h，发现随着培养时间的增加，葡萄糖消耗率也逐渐增加，表明细胞胰岛素抵抗越来越明显，当培养96 h后，培养基上清液中的葡萄糖与对照组比较差异有极显著性意义（14.38±0.489 mmol·L^-1 vs 11.05±0.386 mmol·L^-1，P=0.0003），葡萄糖消耗率也达到最大30.18%（图 3B），此时3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗状态最明显。培养120 h后，模型组葡萄糖摄取增加，与对照组比较无统计学意义。所以，3T3-L1诱导的最佳时间为96 h。

图 3(Figure 3)

图 3 IR-3T3-L1细胞最佳诱导时间的确定 Figure 3 Optimal induction time of IR-3T3-L1 cells. A: Effect of treatment time of insulin on insulin-resistance of 3T3-L1 cell; B: Glucose consumption rate of IR-3T3-L1 cell at different time points (Mean±SE, n=6). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

稳定性试验的目的是考察IR-3T3-L1细胞在本实验的温度、湿度、DEX诱导浓度等影响下随时间变化的规律，为后续实验提供科学依据。由表 2，可见，IR-3T3-L1细胞在正常培养基培养36 h内，上清液中的葡萄糖消耗值与对照组比较均具有显著性差异（P < 0.001）。

表 2(Table 2)

表 2 IR-3T3-L1细胞稳定时间表 Table 2 The maintaining time of insulin resistant 3T3-L1 cells (Mean±SD, n=6) Group Concentration of DEX (μmol·L-1) Remained glucose in medium (mmol·L-1) 24 h 36 h 48 h Control 0 22.03±0.31 19.18±0.31 14.94±0.38 DEX 1 24.17±0.29*** 21.52±0.35*** 16.02±0.43 P - 0.0005 0.0006 0.0876 ***P<0.001 vs control.

表 2 IR-3T3-L1细胞稳定时间表 Table 2 The maintaining time of insulin resistant 3T3-L1 cells (Mean±SD, n=6)

脂肪前体细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化的特异化前体细胞。应用脂肪前体细胞建立的体外IR模型已被广泛应用于胰岛素增敏剂药物作用的评价和研究^[9-11]。国外已经建立了来源于小鼠的脂肪前体细胞株，例如3T3-L1，3T3-F442A，ob17等系列，并且已被应用于医学生物学研究的各个领域。其中3T3-L1细胞株的应用最为广泛。

3T3-L1细胞系是在1974年Green和Kehinde由Swiss mouse embryo的3T3-L1成纤维细胞所分离克隆出来，此细胞具有高度接触抑制性，可由前脂肪细胞转换成脂肪细胞形态。3T3-L1细胞不但在体外经诱导后可以分化为成熟的脂肪细胞，而且植入小鼠体内后也可以分化并形成脂肪团块，且不易与小鼠原有的脂肪细胞区别^[12]。能较好地模拟活体脂肪组织的功能，是一种研究脂肪细胞生成作用最常用的细胞株。

Yi等^[12]成功以0.5 mmol·L^-1软脂酸与25 mmol·L^-1的葡萄糖加0.6 nm·L^-1的胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗。张颖等^[13]用游离脂肪酸（FFA）制备了3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。叶夏云等^[14]采用10、100、1000 nmol·L^-1的地塞米松建立了3种不同程度的3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞，发现随着DEX浓度的增加所建立的模型胰岛素抵抗程度也增加，但是没有具体考察IR-3T3-L1模型的稳定时间。

本实验发现，3T3-L1细胞从液氮中的冻存状态复苏后，培养需要传代3次，才能够有良好的增殖速率。诱导成功后的3T3-L1脂肪细胞形态变圆，胞浆亮，脂滴含量丰富，成“戒环状”结构，其外表形态、油滴大小、分布样式均与动物身上的白色脂肪细胞相似。

3T3-L1分化为脂肪细胞条件为DMEM培养基中添加1 μmol·L^-1 DEX，0.5 mmol·L^-1 IBMX及胰岛素。由于不同文献使用胰岛素的浓度各不相同，从不加胰岛素^[15]到加1.7×10^-7 mol·L^{-1 [16]}，添加1.7×10^-6 mol·L^{-1 [17]}再到8.6×10^-4 mol·L^-1浓度的胰岛素^[18]，使用范围相差极大。故本实验先探索不同胰岛素对脂肪细胞分化的影响。我们观察到3T3-L1前脂肪细胞在10^-6 mol·L^-1胰岛素之下分化处理3~6 d后，油脂逐渐堆积于细胞内，与Cowherd等^[6]实验观察相近。细胞90%以上转化为脂肪细胞，具有最好的分化效果所以在以后的实验中，以3T3-L1脂肪细胞为实验材料时，胰岛素以10^-6 mol·L^-1浓度作为分化条件。

随后，我们考察了3T3-L1脂肪细胞诱导成胰岛素抵抗细胞的最佳诱导时间及稳定性。我们发现3T3-L1脂肪细胞在1 μmol·L^-1 DEX条件下培养96 h后，葡萄糖消耗率也达到最大30.18%。稳定性试验发现，3T3-L1脂肪细胞在36 h内，上清液中的葡萄糖消耗值与对照组比较均具有显著性差异（P < 0.001），因此，IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞最佳的诱导培养条件为：1 μmol·L^-1 DEX、0.5 mmol·L^-1 IBMX和10^-6 mol·L^-1 Insulin诱导分化为成熟的脂肪细胞后，再用1 μmol·L^-1 DEX培养96 h即可成功诱导为脂肪胰岛素抵抗细胞，在36 h内稳定。