MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约18-22 核苷酸的非编码小分子RNA家族，在转录后水平，通过碱基互补方式与靶向蛋白编码基因mRNA的3'UTR结合， 调控靶基因的表达，引起其降解或抑制其翻译；发挥着类似于癌或者抑癌基因的作用^{[1, 2, 3, 4, 5]}。miRNAs调控着人类基因组中约1/3的蛋白编码基因，包括细胞增殖、分化、代谢、周期、凋亡及个体的发育等在内生命活动^{[6, 7]}。 miR-101 属于miRNAs家族，存在于多种细胞中。成熟的miR-101有21个bp，在各个物种中，具有高度保守的成熟序列。研究表明，miR-101在多种实体肿瘤中如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、垂体腺瘤、肝癌、胃癌、食管癌、卵巢上皮癌、胎儿型横纹肌肉瘤、胰腺癌、骨肉瘤等表达水平下调^{[5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19]}。miR-101可能参与肿瘤的发生、转移与侵袭等过程；并与患者的临床病理特征、生存预后及靶向治疗有关^{[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]}。在实体肿瘤中，miR-101可能起着抑制肿瘤发生发展的作用^[20]。研究表明miR-101和其靶基因在肿瘤细胞的增殖、分化、细胞周期、凋亡、迁移、侵袭转移以及其他过程中起着着一定的作用^{[1, 2]}。miR-101 可抑制肝癌细胞的增殖；克隆形成及细胞周期的转录因子^{[4, 5]}。研究发现，miR-101可抑制胃癌细胞的迁移，增殖能力^[21]。在肺癌细胞中，miR-101 通过靶向调控CXCL12的表达而抑制肺癌细胞的增殖，迁移并促进肿瘤细胞凋亡^[22]。在胰腺癌中，miR-101通过靶向作用于HMGA2 而抑制EMT 过程^[18]。在骨肉瘤细胞中， miR-101靶向抑制c-FOS抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力^[19]。而本课题组前期研究发现，miR-101在低转移的SW480中表达较高，而在高转移SW620细胞中表达较低，成功构建稳定过表达miR-101 的细胞株SW620，并发现在结直肠癌细胞株中miR-101可靶向调控RACl表达^[23]。miR-101可调控多种肿瘤细胞的生物学行为，而其对结直肠癌细胞SW620的生物学特性的影响的研究甚少，值得我们探讨。

结直肠癌细胞株SW620由本实验保存。稳定过表达miR-101 细胞株miR101-SW620 及其阴性对照GV209-SW620由本课题组前期构建^[1]。

RPMI 1640 培养基和胎牛血清均购自Hyclone。 CCK8试剂盒（日本同仁）购买于北京智杰方远科技有限公司，细胞周期试剂盒、细胞凋亡试剂盒均购买于南京凯基生物科技发展有限公司。

取生长状态良好的细胞，消化后计数接种于96 孔板中，每孔细胞2000 个，每孔体积为100 μL，每组设置3 个复孔。待细胞贴壁后，使用CCK-8 试剂检测每一组的A值，以确保每孔细胞数比较一致。然后在每天同一时间点每孔加入10 μL CCK-8试剂后37 ℃孵育2 h，以blank 对照孔进行调零，使用GloMaxTM96 Microplate Luminometer发光检测仪测量其A值，用相对应的A值表示该组细胞增殖能力的大小。每组取3孔的平均值，并绘制增殖曲线，重复实验3次。

取生长状态良好的细胞，用PBS液洗3次，然后用胰酶消化，反复吹打细胞悬液，制成单细胞悬液进行细胞计数，以每孔200个细胞密度接种于6孔板内，细胞培养21 d后，取出6孔板，吸去培养液，用PBS洗3次，空气干燥后用多聚甲醛固定15 min。然后使用苏木素染色20 min后用流水缓慢洗去染液，于空气干燥后肉眼计数其形成的克隆数（在显微镜下其细胞数目≥50个细胞作为一个克隆）。按照公式平板克隆的形成率=形成克隆数目/接种的细胞数目×100%分别计算其克隆形成率。

取状态良好的细胞接种于6孔板内待细胞密度在80%以上时，弃去6孔板内的培养基，用预冷的PBS 清洗2 次，然后加入胰酶消化，待细胞收缩变圆的时候终止消化，轻柔吹打细胞使其成为单细胞悬液后将其加入1.5 mL EP 管中，2000 r/min，离心5 min，尽量将PBS去除。然后每个EP 管中加入70%冰乙醇500 μL固定细胞，置于4 ℃中过夜。第2 天拿出EP 管，于室温下1000 r/min，离心5 min，然后PBS 清洗2 次后，然后加入100 μL RNase A，置于37 ℃水浴30 min 后，再加400 μL的PI，将其混和均匀，4 ℃避光30 min。使用流式细胞仪上机检测，记录激发波长488 nm 处红色荧光， 每组设3 个复孔。

取生长状态良好的细胞，接种于6孔板内，待细胞密度约80%时，然后吸去6孔板内的培养基，冷PBS洗2 次，然后用不含EDTA的胰酶进行消化细胞，收集细胞放置于EP 管内，用PBS洗涤细胞2次（2000 r/min离心5 min）收集1~5×10⁵细胞，然后加入500 μL 1×Binding Buffer 悬浮细胞，然后加入1 μLAnneXinV-PE，轻轻地混匀后于4 ℃避光反应15 min，加入5 μL 7AAD，再次混匀，于4 ℃避光孵15 min，1 h 内使用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。CCK8及细胞周期分析值比较采用析因分析和单因素方差分析， 多重比较方差齐时采用LSD法、方差不齐时用Dunnett T3法。P＜0.05 时，差异有统计学差异。

采用CCK-8 法检测过表达miR-101 后SW620 各组细胞的体外增殖能力的变化，并绘制生长曲线（表1， 图1）。析因方差分析结果显示：SW620细胞各组生长时间水平具有显著性差异（F=4152，P＜0.05），组间具有显著性差异（F=10220，P＜0.05），时间与组间交互效应有显著性差异（F=1825，P＜0.000）。以上结果表明， 与空白组、对照组相比，miR101-SW620组的增殖速度明显降低，提示miR-101能抑制SW620细胞的体外增殖能力。

表1(Table 1)

表1 CCK-8增殖实验检测miR-101对SW620细胞增殖的影响Table 1 The effevtion of overexpression miR-101 on SW620 by CCK8 assays SW620 GV209-SW620 mir101-SW620 F P Day 1 0.0167±0.0012 0.017±0.0017 0.0173±0.0012 0.176 0.842 Day 2 0.0403±0.0042 0.0367±0.0021 0.0223±0.0015 33.391 0.001 Day 3 0.0717±0.0055 0.0553±0.0032 0.0233±0.0021 120.896 0.000 Day 4 0.3507±0.026 0.13±0.02 0.074±0.0036 176.123 0.000 Day 5 0.839±0.022 0.1993±0.0047 0.1173±0.0078 2547 0.000 Day 6 0.9683±0.0255 0.2227±0.0078 0.126±0.0115 2267 0.000 Day 7 1.4553±0.0085 0.2893±0.0031 0.172±0.004 46390 0.000

表1 CCK-8增殖实验检测miR-101对SW620细胞增殖的影响 Table 1 The effevtion of overexpression miR-101 on SW620 by CCK8 assays

图1(Fig.1)

图1 miR-101过表达处理后SW620细胞的体外增殖情况 Fig.1 In vitro proliferation of SW620 cells with miR-101 over-expression.

利用平板克隆形成实验检测过表达miR-101后细胞体外增殖能力的变化。平板克隆实验的结果为SW620空白对照组、GV209-SW620对照组和miR101- SW620 组的克隆形成率分别为：44.33%、48.17%、 35.17%。单因素方差分析结果显示SW620 3组细胞间的克隆形成能力差异具有统计学意义（F=73.015，P＜0.001，图2）。与SW620空白对照组、GV209-SW620对照组相比，过表达miR-101 组细胞克隆形成率明显降低，表明过表达miR-101 后，可能抑制结直肠癌细胞SW620的增殖能力。

图2(Fig.2)

图2 miR-101 对SW620 细胞平板克隆形成能力的影响 Fig.2 Effect of miR-101 over-expression on plate colony formation of SW620 cells). A: SW620; B: GV209-SW620; C: mir101-SW620; D: Comparison of plate colony formation efficency among the 3 groups (*P＜0.05).

利用流式细胞仪技术检测分析过表达miR-101 后对结直肠癌细胞SW620 的细胞周期进程的影响（表2，图3）。细胞周期分析发现SW620各组细胞间其G₁、S、G₂/M期存在着统计学差异（F=45.974，P=0.019； F=122.139，P=0.000；F=115.171，P=0.000）。除了SW620 和GV209-SW620 的G₂ 期分布无统计学差异外（P= 0.441），其余各组G₁、G₂/M 期存在着统计学差异（P＜0.01）；与SW620和GV209-SW620相比，mir101-SW620 组出现了明显的G₁和G₂/M期周期阻滞。

表2(Table 2)

表2 流式细胞仪分析过表达miR-101后对结直肠癌细胞SW620各组细胞周期的影响Table 2 The effection to colorectal cancer cell cycle with overexpression miR-101 in SW620 by flow cytometry Cycle SW620 GV209-SW620 mir101-SW620 F P G1 0.3789±0.0089 0.4096±0.0081 0.4328±0.0008 45.947 0.000 S 0.5121±0.0063 0.4815±0.0109 0.4031±0.0087 122.139 0.000 G2 0.1090±0.0044 0.1055±0.0023 0.1635±0.0076 115.171 0.000

表2 流式细胞仪分析过表达miR-101后对结直肠癌细胞SW620各组细胞周期的影响 Table 2 The effection to colorectal cancer cell cycle with overexpression miR-101 in SW620 by flow cytometry

图3(Fig.3)

图3 流式细胞仪分析过表达miR-101后对结直肠癌细胞SW620周期的影响 Fig.3 Flow cytometry for analyzing the effect of miR-101 over-expression on cell cycles of SW620 cells. A: SW620; B: GV209-SW620; C: mir101-SW620; D: Comparison of cell cycle distribution among the 3 groups.

流式细胞仪检测过表达miR-101后SW620各组细胞凋亡的情况（图4）。细胞凋亡实验发现SW620、 GV209-SW620、miR101-SW620 细胞各组细胞凋亡率分别为（0.0217±0.0016）、（0.0270±0.0018）、（0.0999± 0.0015）；差异有统计学意义（F=6115，P＜0.05），各组进行两两比较，均有统计学差异（P＜0.01）。与SW620空白细胞组、GV209-SW620对照组相比，miR-101过表达组细胞凋亡率增加（P＜0.05）。

图4(Fig.4)

图4 过表达miR-101后对结直肠癌细胞SW620各组细胞凋亡的影响 Fig.4 Effect of over-expression of miR-101 on apoptosis of SW620 cells. A: SW620; B: GV209-SW620; C: mir101-SW620; D: Comparison of apoptotic cell rates among the 3 groups.

miR-101 在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、垂体腺瘤、 肝癌、胃癌、食管癌、卵巢上皮癌、胎儿型横纹肌肉瘤、胰腺癌、骨肉瘤、胆囊癌等多种实体肿瘤中表达水平下调，表明其可能与肿瘤的发生、转移、侵袭等过程相关，具有抑制肿瘤发生的作用^{[5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24]}。Wang 等^[25]的研究表明，在胃癌细胞及其组织中miR-101 的表达均下调，并且与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。有研究表明miR-101 下调EZH2 的表达抑制食管癌细胞的增殖、迁移能力、促进肿瘤细胞凋亡；通过靶向作用于CXCR7 而抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力，通过调控血管内皮生长因子C抑制肝癌细胞的迁移和侵袭^{[5, 14, 26]}。本课题组在前期研究中利用慢病毒GV209-mir101 载体及其阴性对照载体转染结直肠癌细胞株SW620，从而实现了miR-101 的长期稳定表达，成功构建稳定过表达miR-101 的细胞株SW620，为进一步研究miR-101 对结直肠癌细胞生物学特性的影响提供了基础^[23]。

本研究通过CCK8 细胞增殖实验、平板克隆实验发现miR-101 可能抑制结直肠癌细胞的增殖。 Strillaccia 等^[27]研究发现，miR-101 在结肠癌患者的癌组织标本中表达明显低于其癌旁组织，高表达miR-101后可抑制结肠癌细胞的远处转移。Lin 等^[28]发现miR-101 通过靶向作用于Rac1 抑制甲状腺乳头状癌细胞的生长，本课题组前期研究发现，在结直肠癌细胞株中miR-101 可靶向调RACl 的表达^[23]，表明miR-101 可能靶向调控RAC1 抑制结直肠癌细胞的生长，和Lin 等的研究结果一致。这提示miR-101 可能发挥着抑制结直肠癌发生的作用，其具体机制值得我们进一步探讨。

细胞周期结果表明，miR-101 可调控结直肠癌细胞周期，使其细胞出现了G₁和G₂/M 期周期阻滞。G₁ 期周期阻滞表明细胞的增殖速度减慢，提示miR-101 可能抑制结直肠癌细胞的增殖。放射治疗是治疗肿瘤病人的重要方式之一，而其效果如何，与肿瘤细胞周期分布密不可分，通常认为G₂/M 期对放疗最为敏感，G₁次之，S期最不敏感。细胞发生G₂/M 期阻滞时将无法完成其DNA 损伤修复，从而引起G₂/M 期阻滞延长，细胞的增殖能力下降，导致细胞增殖死亡^[29]。 转移是结直肠癌患者死亡的主要原因，放射治疗对发生转移的患者具有一定的作用。过表达miR-101后细胞出现了明显的G₂/M期周期阻滞，表明miR-101可能增加结直肠癌细胞的放疗敏感性，其是否能增强结直肠癌患者对放疗的敏感性，延长患者预后值得我们进一步探讨。细胞凋亡实验表明，miR-101 可能促进结直肠癌细胞的凋亡。研究表明在食管癌、卵巢上皮癌、胎儿型横纹肌肉瘤、肝癌及侵袭性子宫内膜癌等肿瘤细胞中，miR-101 通过下调EZH2 的表达而抑制肿瘤细胞的增殖、迁移能力，促进细胞凋亡，并可以促进肿瘤细胞对化疗药物的敏感性^{[14, 15, 16, 30, 31]}。miR-101 是否能增强结直肠癌对化疗敏感性及其及其分子机制， 值得进一步研究。

本研究通过CCK-8增殖实验、平板克隆形式实验， 细胞周期和凋亡实验，发现了miR-101可能抑制结直肠癌细胞SW620的增殖、细胞G₁、G₂/M周期阻滞，促进细胞凋亡。有文献报道miR-101 并可通过调控PI3K/ AKT/mTOR 信号通路抑制胃癌细胞的细胞活力、克隆形成、迁移侵袭能力并促进肿瘤细胞的凋亡^[32]。Bao等^[24] 发现miR-101 通过调控MAPK/Erk 及Smad 信号通路抑制胆囊癌的转移和侵袭。Chandramouli等^{[27, 33]}发现在结直肠癌细胞中，miR-101可在转录后水平调控EP4 受体和Cox-2的表达从而调节肿瘤的发生发展。在结直肠癌细胞中，miR-101的缺失可以通过Wnt/β-catenin 信号通路促进结直肠癌细胞的恶变^[34]。而我们在前期研究发现miR-101 可靶向调控结直肠癌细胞株RACl 的表达，本研究发现miR-101可能抑制结直肠癌细胞的生物学行为^[23]。这表明miR-101 可能通过靶向调控RAC1的表达参与调控结直肠癌细胞的生物学行为，抑制结直肠癌的发生发展及浸润转移。RAC1是癌基因， 与肿瘤的发生、转移、侵袭、细胞凋亡、周期调控和肿瘤新生血管的形成密切相关，参与PI3K-Rac1-JNK、 NF-κB-JNK等信号通路^{[35, 36, 37, 38]}。为进一步探讨miR-101 在结直肠癌的发生发展、浸润转移的分子机制及靶向治疗制提供了一定的理论依据。而在临床应用中， miR-101是否可能增强结直肠癌患者对放化疗的敏感性，并成为结直肠癌患者靶向治疗及预后的生物学指标值得进一步探讨。