肝细胞性肝癌（下称肝癌）是我国常见的恶性肿瘤之一^[1]。目前肝癌治疗仍然以外科手术切除或肝移植为主，但由于该病起病隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，而失去了手术治疗时机。因此，发现和鉴定可用于肝癌早期诊断的分子指标，对提高肝癌的早诊率和加强患者的预后有着重要的临床意义。

微小RNA（miRNA）是一类内源性非编码RNA，长度为18~25个核苷酸。近年来的研究表明其在多种肿瘤中均与肿瘤发生、发展、复发、转移等密切相关，发挥着癌基因及抑癌基因的功能^{[2, 3]}。miRNA作为新兴的生物标志物逐步受到研究者的关注，并且有望成为肿瘤诊断标志物及治疗的潜在靶点。

已有研究表明miR-107在多种实体肿瘤中异常表达，其异常表达与肿瘤的发生发展密切相关，并可作为判断不良预后的分子指标。但是，目前的研究表明， miR-107在不同的肿瘤中发挥相反的作用。例如，在肾透明细胞癌中，miR-107表达下调，发挥抑癌基因的作用，且与肿瘤的大小、侵袭、转移呈负相关^[4]。然而，在结肠癌中，其表达上调，发挥着癌基因的作用，且与肿瘤的不良预后呈正相关关系^[5]。由此推测，miR-107发挥作用可能具有组织或肿瘤依赖性。在肝癌中miR-107的研究报道较少，因此，本研究拟探讨miR-107 在肝癌组织中的表达及临床意义，并初步探讨miR-107在肝癌中的作用机制。

收集2009年9月~2012年10月在南方医科大学南方医院接受肝癌切除手术治疗的22 例肝癌患者的肝癌及相应癌旁组织标本。收集南方医院病理科2005年9月~2010年8月石蜡包埋的53例肝癌组织标本。所有患者术前均未行放射、化疗及射频消融等治疗，且所有组织标本经术后病理学检查均证实为肝细胞性肝癌。

石蜡包埋的53例患者中，男性41例， 女性12例，年龄>55岁22例，年龄≤55岁31例。TNM 分期为I~Ⅱ期47例，Ⅲ~Ⅳ期6例。肿瘤大小>5 cm 34 例，肿瘤大小≤5 cm 19 例。肝外转移3 例，未转移50 例。复发20例，无复发33例。

人肝癌细胞株Huh7 购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、高糖DMEM 培养基、培养基购自GIBCO；胰蛋白酶消化液购自吉诺公司；Lipofectamine RNAiMAX、TRIzol Reagent 购自Invitrogen；SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）购自TAKARA；miR-107特异性引物、内参U6引物由上海英潍捷基公司合成；miR-107 模拟物（mimics）， AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA、AUAGCCC UGUACAAUGCUGCUUU及对应阴性对照（negative control,nc），序列：UUCUCCGAACGUGUCACGUT T、ACGUGACACGUUCGGAGAATT 和抑制剂（inhibitor），序列：UGAUAGCCCUGUACAAUGCUG CU，对应阴性对照（negative control,nc），序列：CAGU ACUUUUGUGUAGUACAA由上海吉玛公司合成；四氮唑蓝（MTT）粉末、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma 公司。

基因数据来源：TCGA 数据集（TCGA cohort）来源于TCGA 数据库（https://tcga-data.nci. Nih.gov/tcga/），数据包含372个肝癌组织样本及50个癌旁组织样本。GSE6857 数据集（GSE6857 cohort）、 GSE10694数据集（GSE10694 cohort）、GSE21362数据集（GSE21362 cohort）来源于GEO 数据库（http:// www.Ncbi.Nlm.nih.gov/geo）。GSE6857 数据集由Xin Wei Wang提交，包括241对肝癌样本^[6]；GSE 10694 数据集由Li W提交，包括78对肝癌样本及10例正常肝样本^[7]；GSE21362数据集由Akira Myomoto 提交，包括73对肝癌样本^[8]。

人肝癌细胞株Huh7采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，2~3 d用胰酶消化、传代培养，取生长状态良好的细胞用于实验。

按照说明书步骤用Trizol 提取收集细胞、肝癌组织及癌旁组织中的总RNA，对A₂₆₀/A₂₈₀ 在1.8~2.0 之间的RNA标本进行逆转录，利用PrimeScript 逆转录PCR（RT-PCR）试剂盒将总RNA 逆转录出miR-107 和U6 snRNA（作内参）的cDNA。我们用SYBR Premix PCR试剂盒按照说明书进行实时定量PCR实验，所有实验重复3次。我们用delta- CT求基因相当表达量方法^[9]分析miRNAs的表达水平。

按照说明书我们用Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂转染miR-107 mimics和inhibitor入肝癌细胞中。在转染12 h 前先将细胞铺到6 孔板中。每孔先将50 pmol miR- 107 mimics（inhibitor）或阴性对照序列与4 μL LipofectamineRNAiMAX分别加至250 μL Opti-MEM 中孵育5 min，然后将两者轻轻混合，室温孵育20 min后加入到各个孔中。在培养箱中培养48 h即可进行下一步实验。

细胞增殖活力是根据四氮唑比色实验即MTT实验来测定。转染24 h后，细胞分两组（nc 组，inhibitor 和mimics 组）进行消化，用DMEM培养基重悬制成单细胞悬液，铺96 孔板，每孔800 个细胞96 孔板的左上孔设为空白孔，只加培养基，不加MTT 及细胞，用于设备调零，每组设6个复孔。细胞贴壁后每天同一时间用一块板，每孔加20 μL浓度为5 mg/mL 的MTT试剂，细胞再避光培养4 h。然后去上清，用100 μL DMSO溶甲瓒沉淀，37 ℃振摇孵育10 min。最后在酶标仪上测定各孔490 nm的吸光度A值。

所有计量数据采用均数±标准差表示，采用SPSS20.0 统计软件进行分析，样本均数的比较采用Student's t检验，双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

TCGA 及GEO 肝癌microRNA 表达谱数据结果示，miR-107在肝细胞癌组织中表达显著高于其在癌旁组织中的表达（P＜0.05，图1）。22 对新鲜肝癌组织中miR-107 表达的检测结果验证了以上数据库结果（P＜ 0.05，图2）。

图1(Fig.1)

图1 miR-107 在数据库中肝细胞癌组织及癌旁组织中的表达水平比较 Fig.1 Expression levels of miR-107 in HCC tissues. A: miR-107 expression in TCGA cohort; B: miR-107 expression in GSE6857 cohort; C: miR-107 expression in GSE10694 cohort; D: miR-107 expression in GSE21362 cohort. ***P＜0.05 vs normal tissues.

图2(Fig.2)

图2 miR-107 在肝细胞癌组织及对应癌旁组织中的表达水平比较 Fig.2 Expression Levels of miR-107 in 22 pairs of human HCC tissues and adjacent noncancerous tissues. *P＜0.05 vs normal tissues.

研究发现在肝癌患者中，miR-107表达水平与肿瘤的大小（P=0.032）呈正相关，而与患者性别（P=0.156）、 年龄（P=0.378）、肝硬化水平（P=0.615）、甲胎蛋白水平（P=0.279）、门静脉癌栓（P=0.31）、巴塞罗那分期（P=0.058）、肿瘤性质（P=0.607）、是否复发（P=0.292）、是否转移（P=0.982）尚未发现有相关性（表1）。

表1(Table 1)

表1 肝癌组织中miR-107的表达与临床病理参数的关系Table 1 Correlation between miR-107 expression and clinicopathologic features of the HCC patients Factor MiR-107 expression levels P High expression Low expression Gender Male 25 16 0.156 Female 10 2 Age (years) ≤55 22 9 0.378 >55 13 9 Edmondson grade Ⅰ+Ⅱ 31 16 0.973 Ⅲ+Ⅳ 4 2 Liver cirrhosis With 22 10 0.615 Without 13 8 AFP (ng/mL) ≤20 13 4 0.279 >20 22 14 Portal vein tumor thrombus No 27 16 0.31 Yes 8 2 No. tumor Solitary 27 15 0.607 Multiple 8 3 Tumor size (cm) ≤5 9 10 0.032* >5 26 8 BCLC stage A 20 15 0.058 B+C 15 3 Relapse 0.292 Yes 15 5 No 20 13 Extrahepatic metastasis 0.982 Yes 2 1 No 33 17 Abbreviations: AFP, alpha-fetoprotein; BCLC, Barcelona Clinic Liver Cancer. *The values had statistically significant differences.

表1 肝癌组织中miR-107的表达与临床病理参数的关系 Table 1 Correlation between miR-107 expression and clinicopathologic features of the HCC patients

用Huh7细胞过表达miR-107后，细胞增殖能力明显增强。相反，沉默miR-107后，细胞增殖能力明显减弱（P＜0.05，图3）。

图3(Fig.3)

图3 上调（下调）miR-107 的表达促进（抑制）肝癌细胞的增殖 Fig.3 Transient transfection of miR-107 mimics (A) and inhibitor promoted and inhibited the cell proliferation of HCC cell line, respectively, shown by the results of MTT assay. Data are shown as Mean ± SD from 3 independent experiments. ***P＜0.05 vs nc.

目前的研究表明，许多miRNA 在肿瘤组织中表达失调，并且呈现肿瘤组织特异性的表达方式。 miRNA的这个特点为其在肿瘤的诊断和治疗的应用提供了新的途径。miR-107 位于人类10 号染色体，其在肿瘤中呈现过高或过低表达，发挥着癌基因和抑癌基因的作用。例如，其在结肠癌高表达，而在肾癌中低表达^{[4, 5]}。因此，深入探讨miR-107在不同肿瘤中的作用有着非常重要的意义。本文主要探讨其在肝癌中的表达及初步探讨其作用机制。我们利用TCGA及GEO数据库中肝癌microRNA表达谱数据进行统计分析，结果提示miR-107在肝癌组织中高表达。提示异常表达的miR-107可能在肝癌中发挥着癌基因的作用。

本研究进一步利用qRT-PCR方法检测了22 对新鲜肝癌及其对应的癌旁组织中miR-107的表达情况，也发现miR-107在肝癌组织中高表达，结果与之前数据库分析一致。为了更深入地探讨miR-107在肝癌中的临床意义，我们进一步分析了53例石蜡包埋的肝癌组织miR-107的表达水平与肝癌临床病理特征间的相关性， 发现miR-107 与肿瘤大小呈正相关。以上结果提示miR-107可能与肝癌细胞的增殖能力相关。为了证明这一点，我们选取肝癌细胞株Huh7细胞进行过表达和沉默后检测其增殖能力，结果表明miR-107可增强肝癌细胞增殖能力。这与Jun-Hong Hu等报道miR-107促进hepG2细胞增殖的结果相一致^[10]，然而，贾振亚等曾报miR-107可抑制hepG2细胞的增殖^[11]。本研究首先从临床分析中得到miR-107与肿瘤大小呈正相关，并且体外实验证实其具有促进增殖作用。我们猜测这可能由于细胞生物学特性及下游靶基因的不同所致，也可能是贾振亚等的研究结果仅局限在细胞水平所致。

综上所述，本研究对TCGA及GEO数据集、新鲜肝癌标本、石蜡标本，肝癌细胞株等多个方面进行研究分析，发现miR-107 可能是一个肝癌发生发展相关的基因。提示，miR-107可能成为肝癌治疗的新的靶点,也可能成为观察肝癌快速增殖的一个新指标。然而本文也存在一些不足，如样本量少，未进行体内实验以及未进行靶基因的探讨。我们下一步将采取加大样本量和体内动物实验的方法来深入探讨miR-107在HCC中的生物学作用、机制及临床意义。