2016, Vol. 36
右江民族医学院附属医院2检验科，广西 百色 533000
2Department of Laboratory Medicine, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, China
人类在种族、地域间的差异性，归根结底是DNA的分子差异。随着人类基因组扫描的推进我们发现，遗传的多态性是普遍存在于人类基因中一种遗传现象。而在遗传多态中，最常见的就是单核苷酸（SNPS）多态性。它有着稳定，相对多变的双重性质。近年来发现， SNPS多态性不仅仅是人类族群与地域代表的遗传标志，它还与疾病的易感、流行、免疫等方面存在着相关性[1]。白细胞介素33（IL-33）是白细胞介素1（IL-1） 家族中的新成员，被Schmitz等[2]发现于2005年。IL-33 在炎症、微生物感染、自身免疫性疾病及心血管疾病中及都有所参与且存在着显著的遗传相关性[3, 4, 5, 6, 7]。通过查找人类基因扫描图谱我们发现，IL-33 基因SNPS： rs1891385A/C、rs10975519C/T多态性在其所公布的四个人群中存在着明显差异。我们本次研究的IL-33基因SNPS：rs1891385A/C、rs10975519C/T 多态性在广西壮、汉人群中的分布，在国内外均是首次报道。望为IL-33基因多态性在地域、种族间的分布提供更多的研究基础。
1 对象和方法 1.1 对象研究对象共283人，男72例，女211例。年龄19~65 岁。其中壮族192例，汉族91例，民族筛选界定条件为： 三代直系亲属中均为本民族的健康体检者。样本均取自右江民族医学院附属医院体检中心。所有研究对象均为广西地区，相互无血缘关系。以上研究对象均签署知情同意书。此研究已通过本单位的伦理委员会批准。
1.2 方法 1.2.1 DNA 提取取静脉血2 mL，加入EDTAN2 抗凝。用（亚能生物TM全血DNA快速提取试剂盒）提取DNA，-70 ℃保存。
1.2.2 引物的合成通过primer3 在线软件（http:// primer3.ut.ee/）设计引物，由上海天昊生物科技有限公司进行合成。rs1891385A/C 上游引物：CAAACAAG CAACAAAATCCCACTCA下游引物：AATGGGACC TGACCCTGGACTT 延伸引物：TTTTTTTTTTGATT TTGGGTTAGTATTAAAATCTTTrs10975519C/T 上游引物：GAGCATATTCGTGCATTTTTGAGACC下游引物：ACCCAGCCCTCCAAATTACCTG延伸引物： TTTTTTTTTTGAGGGGTGTTGAGACTCATA。
1.2.3 PCR扩增及基因测序扩增反应体系共20 μL，包含1.0 μL模板DNA，2.0 μL PCR缓冲液，2.0 μL dNTPs， 1.0 U TaqDNA聚合酶，以及两端引物各1.0 μL。剩余体积用灭菌双蒸水补足20 μL。使用热启动Taq 酶（Qiagen 公司）进行多重PCR 所获得的PCR产物，通过虾碱酶（SAP）（Promega公司）和外切酶Ⅰ（Epicentre公司）进行纯化。延伸反应使用ABI 公司的SNaPshot Multiplex kit来进行。延伸产物在ABI3730XL上样并用GeneMapper4.1分析其基因多态性。并采用测序法进一步验证我们的结果。
1.2.4 统计学分析用SPSS13.0 统计软件包分析数据。各位点基因型及等位基因频率采用直接计数法，两组间基因型及等位基因的频率分布差异采用χ2检验，P＜ 0.05代表差异有统计学意义。遗传平衡分析用Hardy- Weinberg平衡检验。
2 结果 2.1 IL-33 基因位点rs1891385A/C、rs10975519C/T 的基因分型经Hardy-Weinberg 平衡检验分析，两位点基因型均达Hardy-Weinberg 平衡，结果具有群体代表性。 rs1891385A/C与rs10975519C/T两位点扩增产物分别为273 bp与235 bp。rs1891385A/C存在AA、AC、CC 3 种基因型。rs10975519C/T 存在CC、CT、TT 3 种基因型。基因测序证实了我们的检验结果（图1，2）。 2.2 两位点在广西人群中壮、汉族之间的分布IL-33 基因rs1891385A/C 的3 个基因型：AA、AC 和CC在广西地区壮、汉族之间的分布差异无统计学意义（P>0.05）。rs10975519C/T的3个基因型：CC、CT和TT在广西地区壮、汉族之间的分布差异也无统计学意义（P>0.05，表1）。
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图1 IL-33基因rs1891385A/C测序图 Fig.1 Sequencing map for genotyping of IL-33 gene rs1891385A/C polymorphism. The arrows in panels A-C show AA，AC and CC genotypes, respectively. |
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图2 IL-33基因rs10975519C/T 测序图 Fig.2 Sequencing map for genotyping of IL-33 gene rs10975519C/T polymorphism. The arrows in panels A-C show CC, CT and TT genotypes, respectively. |
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表1 IL-33基因rs1891385A/C、rs10975519C/T 基因多态性在壮、汉族间的分布 Table 1 Distribution of genotype and allele frequencies of IL-33 gene rs1891385A/C and rs10975519C/T in Zhuang and Han populations in Guangxi |
IL-33 基因rs1891385A/C 的3 个基因型：AA、AC 和CC在男女两组间分布差异无统计学意义（P>0.05）。 rs10975519C/T 的3 个基因型：CC、CT和TT在男女两组间分布差异也无统计学意义（P>0.05）。两位点的各等位基因频率在男女两组间分布差异也无统计学意义（P>0.05，表2）。
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表2 广西人群IL-33基因rs1891385A/C、rs10975519C/T 基因型和等位基因频率的比较 Table 2 Gender-specific distribution of genotype and allele frequencies of IL-33 gene rs1891385A/C and rs10975519C/T in Guangxi population |
经分析，广西人群rs1891385A/C各基因型及等位基因的分布频率与欧洲人、非洲黑人相比均有显著性差异（P＜0.01）。与北京汉族人及日本人相比差异无统计学意义（P>0.05）。广西人群rs10975519C/T 各基因型分布频率与欧洲人、日本人相比具有显著差异（P＜0.01）。与非洲黑人、北京汉族人相比无显著差异（P> 0.05）。其等位基因分布频率仅与欧洲人之间差异有统计学意义（P＜0.01）。与其他各族人群差异无统计学意义（P>0.05，表3、4）。
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表3 广西人群rs1891385A/C基因型和等位基因分布频率与各种族人群间的比较 Table 3 Comparison of the frequency of IL-33 gene rs1891385A/C polymorphism among different ethical and race groups |
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表4 广西人群rs10975519C/T基因型和等位基因分布频率与各种族人群间的比较 Table 4 Comparison of the frequency of IL-33 gene rs10975519C/T polymorphism among different ethical and race groups |
遗传的信息由基因表达，且每个基因的表达都有其重要的意义。自2003年人类基因组扫描计划的完成， 基因这个复杂的人体密码逐渐被揭开神秘的面纱。目前，SNPS多态性占已知多态性的90%以上，目前已知的SNPS有1500万个左右。每300~600 bp就会出现一个突变的碱基，这种突变广泛存在于人类基因中[8]。我们知道，两个无血缘种族同源关系的独立人类，其基因的序列有99.9%是一致的，而剩下的0.1%却造成了人类之间的巨大差异。越来越多的研究证实SNP多态性不仅是人类种族、地域间差异的标志之一，也是人类疾病及对药物敏感程度的重要影响因素[9, 10]。故研究SNPS在不同人群中的分布，也是揭示人类疾病发生发展的重要途径之一。
广西地处中国西南边界地区，共有40多个民族长期共居，其中，壮族是广西地区的主要民族，其次为汉族。 从我们研究的结果可以看出，IL-33 的rs1891385A/C、 rs10975519C/T 两位点与欧洲人群、非洲人群、甚至同为亚洲人的日本人群间表现出了不同程度的差异，这说明IL-33基因这两个位点存在着较强的地域性差异和种族性差异。而在广西人群壮、汉族之间以及北京汉族人之间并无显著差异，这又从另一方面体现了中国南北人群间两位点间的同源性。基因多态性的分布特点因地域不同，种族不同，环境影响和自然选择而存在着很大差异。我们的研究结果体现了这一特点。IL-33是一种多功能炎性因子。在不同的疾病中，其可表现出保护因子或风险因子的双面性[11, 12, 13, 14]，且其多态性已被证实与多种疾病相关，有研究表明IL-33基因的rs1891385A/C位点在强直性脊柱炎中A等位基因可能是强直性脊柱炎的保护基因[15, 16]。rs1891385A/C、rs10975519C/T 位于IL-33基因的内含子区，内含子区的位点的突变有可能会影响基因的转录，影响基因的表达调控和功能[17]。基因在种族间的分布差异，除了是一种对自然环境的选择及进化的结果以外，也可能是某种疾病在某个地域、种族人群中的发病基础。
随着人类基因相关研究技术的发展和完善，基因多态性的研究不再局限国家与人种等大范围的研究。 国家内部的地区之间，民族之间的细致化研究已成为研究的新方向和新热点。基因多态研究的推进，也使得人类医学开始向“精准医学”的方向发展。我们对广西人群IL-33 基因rs1891385A/C、rs10975519C/T多态性进行研究并报道，这在国内外均为首次。这不仅为IL-33 的基因多态性在人类疾病中研究打下了前期基础，也为中国地区以及民族间的基因扫描尽出了一份绵薄之力。
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