2016, Vol. 362南方医科大学基础医学院，广东 广州 510515
, GAO Ting1, PAN Jinfei1, WEI Haiming1, JIA Chunhong2, LAN Jiao1, CHEN Zhenxiang1, PAN Deng1, BAI Xiaochun2 2College of Basic Medicine,Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率仅次与肺癌排第2 位[1]。乙肝病毒（HBV）、黄曲霉素（AFB1）作为肝癌最主要及最强的两个主要致癌因素已得到广泛共识[2, 3]，但是HBV和AFB1 协同诱发肝癌的分子机制尚未完善阐明，而两者协同作用下诱发肝癌的信号传导通路也甚少。在肿瘤防治研究方面，已发现多不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸（DHA）可能具有较好的预防及治疗效果，但作用的分子机制尚未完全阐明，已有的研究认为可能与DHA影响肿瘤细胞的增殖、凋亡及肿瘤细胞的侵袭转移有关[4, 5]，但是DHA对抑制肝癌细胞的生长、增殖的报道甚少，而且DHA是否可抑制HBV和AFB1 协同发展的肝癌细胞的增长目前没有报道。因此， 本研究特别选用以携带HBV 基因人肝癌HepG2 （HepG2.2.15 肝癌）细胞为研究对象，通过AFB1、 AFB1/DHA 两种方式培养肝癌细胞，观察细胞在不同微环境下其细胞特征的变化，探讨DHA 对AFB1 促进HepG2.2.15 肝癌细胞增殖效应的影响，此模型模拟我国广西肝癌高发区的黄曲霉素暴露环境下携带乙肝病毒人群发展为肝癌的体外内环境，本研究为肝癌的防治提供新的策略及理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料人肝癌HepG2.2.15（携带HBV基因）细胞株购自武汉大学细胞保藏中心；DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco；细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物公司； Transwell 小室购自Corning；基底膜胶（Matrigel）购自B & D；黄曲霉毒素B1（AFBl）、DHA、DMSO 购自Sigma。
1.2 细胞培养及分组人HepG2.2.15细胞株常规培养于DMEM培养基， 置37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中孵育。将处于对数生长期的HepG2.2.15细胞用0.5%的胰蛋白酶消化， 用含血清的培养基制成105/mL的细胞悬液，接种于6 孔板中。实验分3组：空白组、2 μmol/L AFB1处理组、 2 μmol/LAFB1+DHA处理组。
1.3 细胞划痕修复率检测将上述细胞重悬液接种于6孔板中，细胞贴壁培养过夜后，用200 μL无菌枪头在孔内轻轻地划1~3道痕， PBS冲洗去掉脱落的细胞,倒置显微镜下拍照。然后孵育2 μmol/L AFB1，同时添加或不添加50 μmol/L DHA，继续培养24、48 h后，95%酒精固定，Giemsa染色流水冲洗，光镜下（放大50倍）观察刮痕并拍照记录，每组实验重复3次。在照片选取3个不同位置，测量划痕宽度，计算平均值，细胞修复率=1-实际迁徙距离/原始距离。
1.4 细胞能力检测侵袭实验中应用基质胶包被Transwell小室的微孔膜，而迁移实验不用基质胶包被。Transwell上室直接加入上述200 μL的HepG2.2.15细胞重悬液，Transwell 下室内分别加入含2 μmol/LAFB1，同时添加或不添加50 μmol/L DHA，用含10%血清DMEM完全培养液继续培养24、48 h后；95%酒精固定，Giemsa染色流水冲洗。用棉签去除上层小室未穿透的细胞，观察已穿过微孔膜到达迁移小室杯底下面的细胞。镜下随机取5个视野拍照，计数每个视野的细胞数量。
1.5 流式细胞仪分析细胞周期将上述细胞重悬液接种于6 孔板中，分别用含2 μmol/L浓度的AFB1，添加或不添加50 μmol/L浓度的DHA处理细胞，含10%血清DMEM完全培养液继续孵育24、48 h后，收集各组细胞1×106，70%乙醇固定过夜，RNaseA 37 ℃水浴30 min，碘化丙锭（PI）染液染色， 4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪进行细胞周期分析， 得出细胞周期各时相的比例，实验重复3次。
1.6 透视电镜检测细胞超微结构上述细胞重悬液接种于6孔板中，分别用含2 μmol/L 浓度的AFB1处理细胞，添加或不添加50 μmol/L浓度的DHA，含10%血清DMEM完全培养基继续孵育24、 48 h后，以2%戊二醛及1%四氧化锇固定，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，制备超薄切片，醋酸双氧铀染色后， 置透射电镜下观察细胞的超微结构。
1.7 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，不同处理组比较采用单向方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 细胞划痕修复率2 μmol/LAFB1处理24、48 h后细胞划痕修复率均明显高于空白组，同时DHA/AFB1处理组与单独AFB1 处理相比较，细胞的划痕修复率均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，表1）。
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表1 各组细胞划痕修复率比较 Table 1 Comparison of wound healing rates at 24 and 48 h in each group (%, Mean±SD, n=3) |
2 μmol/LAFB1处理组迁移、侵袭细胞划穿膜细胞数目明显高于空白组，同时DHA/AFB1处理组与单独AFB1处理相比较，细胞的穿膜数目均明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05，表2）。
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表2 各组细胞穿膜细胞数目比较 Table 2 Number of cells penetrating the chamber membrane in Transwell assay in each group (Mean±SD, n=3) |
2 μmol/L AFB1处理24、48 h后与空白组比较，G0/ G1期细胞比例明显下降（P＜0.05）；G2/M期细胞比例明显升高（P＜0.05）；而S 期细胞比例均无明显改变（P> 0.05）。同时添加DHA/AFB1处理组与单独AFB1处理的相比较，G0/G1期细胞比例明显升高（P＜0.05）；G2/M期细胞比例明显下降（P＜0.05）；而S期细胞比例均无明显改变（P>0.05，表2，3）。
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表3 各组细胞的细胞周期比例的比较 Table 3 Proportion of the cells in different cell cycle phases in each group (%, Mean±SD, n=3) |
透射电镜下观察，2 μmol/LAFB1 处理24、48 h 后与空白组相比较，细胞出现多核仁，细胞内核仁边集、核质比增高，线粒体增生、数目增多、基质密度增加，内质网增生、扩张、数目增多，高尔基体基氏区增大、数目增多，细胞微绒毛、伪足增多。DHA/AFB1处理组与单独AFB1 处理组相比较，细胞单核仁且核仁皱缩、细胞内核质减少，细胞内线粒体出现絮状物、数目也减少，内质网结构松散，高尔基体数目减少，细胞内空泡化形成（图1）。
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图1 透射电镜下观察各组细胞的超微结构 Fig.1 Ultrastructure of cells under transmission electron microscopy (Original magnification: ×10000). A: Control group; B: 2 μmol/LAFB1 24 h group; C: 2 μmol/LAFB1 48 h group; D: DHA/AFB1 24 h group; E: DHA/AFB1 48 h group. |
在我国，大约80%以上的肝癌与慢性乙型肝炎病毒的高感染率密切相关，此外，以AFB1 为代表的环境致癌物高暴露也是我国肝癌高发病率的重要因素，而这两种危险因素在肝癌发病过程中具有强烈的协同致癌效应，二者同时存在则肝癌的发生风险要比单纯的HBV 感染者高30~60 倍，但AFB1/HBV 协同致肝癌发生的具体机制仍然是不明确[6]。AFB1 浓度在40 mg/L 时可以导致人胚肝细胞DNA损伤， 但不足以造成显著的细胞损害及肝功能异常，但当AFB1 浓度在80 mg/L 时会造成人胚肝细胞损伤及细胞凋亡的发生[7]。AFB1在培养液中浓度达到0.5 μmol/L 时，微量持续的AFB1 刺激肝癌细胞会使得细胞增殖能力大大增强，但是AFB1 浓度达到10 μmol/L时，过高浓度的AFB1 的药物毒性会导致细胞增殖能力的下降，甚至会导致细胞发生凋亡[8]。本研究探索低浓度的AFB1 刺激携带乙肝病毒的HepG2 细胞，建立AFB1/HBV 协同作用下的体外细胞模型，体外模拟AFB1、HBV两种因素协同下的肝癌侵袭转移的微环境，此模型体外模拟我国肝癌广西肝癌高发区在长期AFB1 暴露下携带HBV 人群生长的微环境，可以深入研究AFB1/HBV 协同诱发肝癌的分子机制，探讨干预这些信号通路的有效手段更可为这一高发地区肝癌的防治提供有力证据。
本结果发现，AFB1/HBV 协同作用下的HepG2.2.15 细胞随着时间的延长细胞划痕愈合能力、侵袭迁移能力均增强，细胞G2/M 期增高，这与近年来学者研究发现线粒体的氧化应激[9]、内质网应激反应10[8]、高尔基体相关蛋白的改变参与肝癌细胞的侵袭及转移[10, 11, 12, 13]相一致。提示AFB1/HBV 可能改变HepG2.2.15 细胞的生长的微环境，可能导致氧化应激、内质网应激连锁反应的发生，从而可能激活细胞内的激活子-3、环氧化酶-2、血管生成因子等因子，这些因子相关的信号通路参与可能导致肝癌细胞发生增殖、侵袭及转移。本研究中电镜检测发现HepG2.2.15 细胞超微结构中的线粒体、高尔基体、内质网也相应的增多，提示AFB1/HBV 协同作用可激活高尔基体相关的高尔基体膜蛋白导致上皮间质转化现象产生新的细胞-基质黏附分子，新的黏附分子黏附于细胞外基质，与激活的内质网相关的钙网蛋白产生的基质金属蛋白酶降解了细胞外基质，从而使得肝癌细胞侵袭转移能力增强。电镜检测中观察到DHA/AFB1 处理组与单独AFB1 处理组比较，肝癌细胞呈单核仁且核仁皱缩、细胞内核质减少，细胞内线粒体出现絮状物、数目也减少，内质网结构松散， 高尔基体数目减少，细胞内空泡化形成，提示DHA 能够抑制及拮抗AFB1/HBV的协同作用下的诱导肝癌细胞增殖、侵袭转移。
DHA可诱导乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌等肿瘤细胞发生凋亡，并在一定程度上降低细胞侵袭力，但具体作用机制尚不明确[14, 15]。DHA的这种作用可能与DHA诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞停滞在G2/M期干扰肿瘤细胞周期有关[16]。同时，DHA还可以通过肿瘤抑制因子LKB1 抑制mTOR信号通路减少肿瘤细胞的转移[17]，或刺激产生线粒体ROS 并且抑制AKT-mTOR信号通路诱导p53 突变的癌细胞凋亡[18]。 这些研究结果也提示DHA对肿瘤细胞有直接的抑制效应可能是通过对mTOR通路的抑制有关。在肝癌的已有研究中发现，mTOR信号通路激活在肝癌发生发展中可能具有重要促进作用。本研究结果发现， DHA/AFB1/HBV 共同作用的细胞愈合能力、侵袭迁移能力，细胞G2/M 期明显低于AFB1/HBV 协同作用后的细胞，而且DHA/AFB1/HBV 下的细胞超微结构中的线粒体数目减少，内质网结构松散、细胞内空泡化形成。这些结果提示DHA 对AFB1/HBV 协同作用下肝癌的增殖、侵袭能力的抑制，也可能与DHA改变肿瘤细胞生长的微环境、细胞内线粒体、内质网结构功能及抑制mTOR信号通路有关。
本研究建立AFB1/HBV 协同作用下的体外肝癌细胞模型，将肝癌发生的两个单因素AFB1 与HBV 的结合起来研究肝癌细胞的生物学行为的变化情况。本研究发现AFB1/HBV 协同作用下HepG2.2.15 的细胞侵袭迁移能力增强，细胞超微结构中线粒体、 高尔基体、内质网也相应的增多，这些研究的结果验证了AFB1 与HBV双因素作用下肝癌发生的几率比任何一个单因素肝癌发生的几率高很多，而且为进一步探讨AFB1 与HBV协同诱导肝癌发生的分子机制提供依据。本研究也发现DHA可以抑制肝癌细胞的增长，同时也可以抑制AFB1 与HBV 协同诱导下侵袭迁移能力增强的肝癌细胞，这为DHA抑制肝癌的发生提供了依据，为进一步探讨DHA 如何阻断AFB1 与HBV协同诱导肝癌发生的分子机制提供依据。因此，通过体外细胞模型利用基因分子水平与蛋白组学技术进一步研究细胞内质网、高尔基体及mTOR信号通路相关的蛋白，为研究细胞内质网、高尔基体、线粒体及mTOR 信号通路是否介导AFB1/ HBV促进肝癌发生、发展提供依据。
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