2016, Vol. 36
2 右江民族医学院附属医院 皮肤科，广西 百色 533000
2 Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise 533000, China
精氨酸加压素（AVP）是由下丘脑产生的一种生物活性肽，具有调节渗透压、维持血流动力学稳定及调节中枢神经系统的生物学作用，是体内最重要的应激激素之一[1]。主要通过刺激下丘脑-垂体-肾上腺素（HPA）轴中的下丘脑进而在体内应激反应中发挥作用[2, 3]。其与脑血管疾病、心血管疾病及肾脏等疾病的形成相关[4, 5, 6]。在脑卒中、心力衰竭、急性颅脑损伤等疾病中异常上升的血清AVP水平与疾病不良预后密切相关，提示AVP可能是某些疾病预后的重要标志物[7, 8, 9]。人类20号染色体p13区域存在编码AVP的基因，经人类基因组计划扫描发现AVP基因存在着变异及多态性。基因的改变与疾病发生、发展存在一定的相关性，AVP基因多态性与疾病相关性的研究鲜有报道，而关于AVP 基因rs66818855 和rs1078152 多态性的研究尚未见报道。探究AVP基因多态性位点基因型及等位基因频率在广西健康人群中的分布，并与HapMap数据库公布的4个人群AVP基因分型数据进行比较，这会为我们研究基因在不同族群中的分布差异，进而探讨疾病在不同人群中的遗传规律提供理论依据。因此，我们采用单碱基延伸PCR的方法和DNA测序技术，对广西健康人群AVP基因的多态性进行研究，对于认识遗传因素在疾病中的作用具有重大意义。同时，分析其在广西正常人群中的分布，将为群体遗传学及人类学研究提供相应的遗传数据资料。
1 对象和方法 1.1 研究对象选自2015 年4 月~2015 年8 月右江民族医学院附属医院正常体检者，共303例，其中男181例、女122例，年龄25~80岁。实验室检查正常，除外心脑血管疾病及重要脏器疾病者。所有的研究对象均为广西自然人群，彼此之间无血缘关系，并且签署知情同意书，经伦理委员会批准。
1.2 基因组DNA提取采集研究对象静脉血2 mL，加入EDTA-K2抗凝；选择改良碘化钠法提取基因组DNA，置于-70 ℃保存备用。
1.3 引物的设计与合成根据NCBI 上查找的AVP 基因rs66818855 和rs1078152序列，选择包含位点的序列并输入引物设计软件Primer3，得到用于特异性扩增rs66818855 和rs1078152位点的PCR上下游引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。其中，rs66818855 上游引物5'-CCCGGAATCACTTAGCGCCATCA-3'；下游引物5'-TTTCCTTCACCGGCGAGCGG-3'；延伸引物为5'-TTTTTTTTTTTTGGCAGCGGAGGGGGCTGC-3'。rs1078152上游引物5'-GGTGCCAATTGAGAGTTCCAC-3'；下游引物5'-GTAGGCCACGCGTCCTGTATGA-3'；延伸引物为5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTACCCCGTAGAAG CCCACCC-3'。
1.4 PCR反应AVP基因的PCR扩增反应体系为20 μL，其中含1xGC 缓冲液I（TAKARA）2.0 μL，2.5 mmoL Mg2+，0.2 mmol dNTP，上、下游引物各0.2 μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0 U，DNA模板1 μL，余下体积用灭菌双蒸水补足。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获取，PCR产物经虾碱酶（SAP，购自Promega）和外切酶Ⅰ（EXO I，购自Epicentre）纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶（SNP，购自Promega）纯化后在ABI3130XL上样检测。SNP 分型用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems）来分析。
1.5 统计分析根据测序的结果直接计算出AVP基因两个位点的基因型和等位基因的频率。Hardy-Weinberg遗传平衡检验，不同性别间多态性的比较及与NCBI数据库公布的4 个人群（欧洲人群、非洲人群、日本人群及北京人群）AVP基因rs66818855和rs1078152位点分型结果进行比较，均采用SPSS13.0进行卡方检验计算。对比4个人群与广西人群AVP基因多态性差异，以P<0.05为差异有统计学意义；P>0.05 认为符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律。
2 结果 2.1 AVP的基因型检测结果AVP基因rs66818855和rs1078152的扩增产物大小分别为214 bp、305 bp。经ABI3130XL基因检测单核苷酸多态性（SNP）分型结果显示rs66818855 和rs1078152位点均分别有AA、AG、GG,CC、CT、TT 3种基因型。经过基因测序后得到的数据进一步证实我们所检测到的结果（图1、2）。
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图1 AVP基因rs66818855A/G测序图 Fig.1 Sequencing map of genotypes of AVP gene rs66818855A/G polymorphism. Arrows in panels A, B, and C indicate AA, GG and AG genotypes, respectively. |
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图2 AVP基因rs1078152C/T测序图(互补链) Fig.2 Sequencing map of genotype of AVP gene rs1078152C/T polymorphism. Arrows in panels A, B, and C indicate CC, TT, and CT genotypes, respectively. |
根据检测的结果直接计算AVP基因rs66818855和rs1078152 这两个多态性位点的基因型和等位基因频率。经卡方检验，本次实验样本的AVP 基因rs66818855、rs1078152 基因型和等位基因频率符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P均>0.05），可知各基因型和等位基因频率已达到遗传平衡，具有明显的群体代表性。结果统计显示，广西人群中，AVP基因rs66818855、rs1078152两位点分别以AG，CT基因型多见，分别占43.2%和52.1%；G，C等位基因频率最高，各占58.9%和54.8%。各AVP基因多态性位点在男女间分布没有统计学差异（P均>0.05，表1、3）。
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表1 rs66818855A/G在广西健康人群中的分布 Table 1 Distribution of genotype and allele frequencies of AVP gene rs66818855A/G in Guangxi healthy population [n(%)] |
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表2 不同种族及地区人群AVP基因rs66818855A/G多态性分布频率的比较 Table 2 Comparison of frequency of AVP gene rs66818855A/G polymorphism among different ethic and regional groups |
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表3 rs1078152A/G在广西健康人群中的分布 Table 3 Distribution of genotype and allele frequencies of AVP gene rs1078152A/G in Guangxi healthy population [n(%)] |
将广西人群的AVP基因rs66818855 和rs1078152位点多态性分别与人类基因组计划公布的4个人群的单核苷酸多态性（SNP）分型数据进行比较，结果发现，AVP基因rs66818855、rs1078152两个位点基因型和等位基因频率在广西人群和欧洲人群的差异具有统计学意义（基因型χ2分别为68.30和50.06，等位基因χ2分别为71.22和48.66，P均<0.01），rs66818855位点等位基因频率与非洲人相比差异具有统计学意义（χ2为4.67，P<0.05，表2、4）。
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表4 不同种族及地区人群AVP基因rs1078152A/G多态性分布频率的比较 Table 4 Comparison of the frequency of AVP gene rs1078152A/G polymorphism among different ethic and regional groups |
精氨酸加压素是下丘脑-垂体-肾上腺素（HPA）轴的重要组成部分，在机体生理活动中起重要的调节作用[10, 11, 12]。既往的研究表明，AVP本身及其受体基因的多态性位点可能参与相关疾病的发生[13, 14, 15]。目前，关于AVP基因rs66818855 和rs1078152 多态性的研究在国内外尚未见报道。首先探讨不同地区，不同人群间正常人群AVP基因多态性及其分布的特点，可为我们提供不同地区人群的遗传背景资料，进而为我们研究相关疾病在不同地区人群中的发病情况提供遗传数据支持。
本次研究采用了单碱基延伸PCR的方法和基因测序的技术检测了广西地区正常人群中AVP 基因rs66818855和rs1078152两个位点的多态性分布情况，并对比Hapmap上公布的四个人群（欧洲人群、非洲人群、日本人群和北京人群）的SNP分型数据，分析了5个人群的AVP基因rs66818855和rs1078152位点的基因型和等位基因频率。结果显示同一SNP位点基因型和等位基因的分布在不同人群间存在有差异，不同SNP位点在不同地区人群中分布的差异并不一致。随着全人类基因扫描计划的进行，逐步认识到SNP位点在不同人群中的分布中存在差异，而不同地区人群中SNP位点分布的差异是造成不同地区人群遗传背景不同的原因之一，结合现有的研究，具有不同遗传背景的人群，对疾病的易感性也存在差异，Vazgiourakis等[16]研究发现CD40基因rs4810485与希腊人和土耳其人SLE的发病有关，而Piotrowski等[17]却发现rs4810485与波兰人SLE的发病没有相关性。广西人与北京人，日本人均属黄种人，遗传分类上同属东亚人群，亲缘关系近，其多态性分布相近；而广西人与欧洲、非洲人亲缘关系远，多态性分布差异较大。此外，我国人口众多，地区差异较大，遗传背景复杂。广西地处西南亚热带地区，地理环境，生活方式与北京、日本人存在较大差异。而多态性的分布差异除了与人种相关外，不同地区地理环境、饮食习惯及生活方式造成的后天因素，亦会导致基因多态性分布的差异[18]，进而导致相关疾病在不同人群中的发病情况不同。
因此，分析我国广西健康人群AVP基因rs66818855、rs1078152 位点多态性及其在不同地区人群中的分布，有助于加深我们对群体遗传学的认识，阐明基因改变与疾病发生、发展的联系，为临床上研究不同地区和人群AVP基因相关的多种疾病提供相应的遗传学数据。
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