结直肠癌（CRC）是常见恶性肿瘤，发病率位居2015年我国恶性肿瘤发病男性的第5位和女性第4位，估计2015年CRC新发病人数为37.6万人，死亡人数达到19.1万人^[1]。术后40%~50%患者出现术后复发或转移，其中绝大多数患者失去再治愈的机会；约20%病人在诊断时即处于转移阶段，其中位生存期低于2年^[2]，该类晚期或转移CRC 对化疗药物的反应仅有10%~20%，导致CRC 的远期预后很差^[3]。

《医学入门》记载蟾酥：“主痈疽疔肿瘰疬，一切恶疮顽癣”；《本草纲目》：“治发背疔疮，一切恶肿”。我们此前的研究显示，蟾酥成分沙蟾毒精诱导结肠癌细胞发生凋亡，线粒体磷酸甘油酸变位酶5L（PGAM5L）与动力相关蛋白1 以及Bax 形成复合物对于内源性凋亡的执行是必需的^[4]。远华蟾蜍精（TBG）是从中华大蟾蜍蟾酥中提取纯化的活性成分之一^[5]，但TBG对CRC的作用尚未见报道。本实验旨在分析TBG 对CRC 细胞活力的影响并对其可能的分子机制进行探讨。

人结肠腺瘤上皮细胞系SW480细胞、HCT 116购自美国模式培养物集存库，由南方医科大学中医药学院分子生物实验室保存；远华蟾蜍精购自宝鸡市辰光生物科技公司；细胞培养基RPMI 1640（Hyclone）；胎牛血清（Gibco）；四甲基偶氮唑盐[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]和二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）购自MP；DCFH-DA够自Sigma；Hoechst 33342 试剂盒（上海鼎国生物技术公司）；AnnexinV-7AAD 细胞凋亡检测试剂盒（美国BD）；JC-1 够自MCE 公司；p53、Bax、Caspase 9、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly（ADPribose）polymerase,PARP]一抗、Stress and ApoptosisSignaling Antibody Array Kit购自美国CST。

收集对数期细胞，调整细胞密度约1×10⁵/孔。细胞贴壁后，分别加入浓度梯度的TBG（0、0.1、1.0、2.5、5、10 μmol/L），分别培养24、48 h后，每孔中加入5 mg/mLMTT 20 μL。酶联免疫检测仪A_{490 nm}处测量吸光值。细胞生存率=处理组吸光度值/对照组吸光度值，实验重复3次。

TBG处理细胞24 h，收集细胞，按照我们此前建立的方法，选用Annexin V-PE/7AAD双染试剂盒，操作按试剂盒操作指南进行^[4]，实验重复3次。

贴壁细胞弃培养基，用PBS清洗1~2次。每孔加入35 μL Hoechst 33342工作液，置于37 ℃温育15~20 min。弃去Hoechst 33342染液，PBS洗涤1~2次，用荧光显微镜拍照分析^[4]。

应用DCFH-DA 和JC-1 分别检测细胞内ROS和线粒体膜电位。DCFH-DA孵育30 min，无血清培养液冲洗HCT116细胞3 次，15 min 内各孔荧光强度流式细胞仪检测，结果以与对照组ROS 含量的百分比表示。0.5 mL JC-1工作液染色后，加入250 μL 1×缓冲液，经FACSCalibur流式细胞仪检测，用Cel1Quest软件分析荧光相对强度，观察细胞线粒体膜电位的变化。

用BCA法蛋白定量后，每组取约30 μg蛋白样品，加入5倍上样缓冲液后上样至12% 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，湿转法转印至聚偏氟乙烯膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶偶联的相应二抗（1∶1000稀释）室温孵育1 h。最后用增强化学发光法显色、曝光。每组样品重复上样检测3次。目的条带用Image J 软件分析相对灰度值（以β-actin 为参照）^[7]。

TBG 处理24 h 后，应用全蛋白抽提试剂盒提取蛋白，蛋白用BCA法进行蛋白定量后，每组取约0.5~1 μg/μL浓度的蛋白样品加入组装好的对应黑色多孔隔离槽中过夜孵育。次日用试剂盒中的复合一抗室温震荡反应1 h，辣根过氧化物酶偶联的相应二抗室温震荡孵育0.5 h。最后配置混合后显影试剂用化学发光数字成像仪曝光。目的靶点用Image J软件分析相对灰度值（以阳性对照为参照）。

采用SPSS20.0软件，数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，若方差齐，组间多重比较采用LSD方法检验；若方差不齐多重比较采用Dunnett's T3，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

分别用0、0.1、1.0、2.5、5、10 μmol/L TBG 处理HCT116、SW480 和NCM460 3 种细胞24 h 和48 h，TBG 以浓度及时间依赖方式降低CRC 细胞活力HCT116 和SW480 的细胞活力，到5 μmol/L细胞增殖抑制率达到平台水平（图1A，B）。TBG对人正常肠上皮细胞NCM460的杀伤作用较结肠癌细胞减弱（图1C）。HCT116细胞的24 h IC50值为3.93 μmol/L，SW480细胞的24 h IC50值为5.10 μmol/L，NCM460细胞的24 h IC50值为34.7 μmol/L，表明TBG对CRC肿瘤细胞有更强杀伤作用。

图1(Fig.1)

图1 TBG对HCT116、SW480和NCM460细胞活力的影响 Fig.1 Effects of telocinobufagin on viability of HCT116 (A), SW480 (B) and NCM460 (C) cells assessed with MTT assay. *P<0.05, #P<0.01 vs control (0 μmol/L).

Annexin V-PE/7AAD双染的流式细胞分析结果显示（图2A），随着TBG浓度的增加，HCT116的细胞凋亡率逐步上升。0.1、1.0、2.5 μmol/L TBG引起的AnnexinV阳性细胞比例分别是（7.63±0.33）%、（9.33±0.76）%、（12.24±0.91）%（图2C），表明TBG显著增加HCT116细胞凋亡率。

图2(Fig.2)

图2 TBG对HCT116细胞凋亡的作用 Fig.2 Effect of telocinobufagin on apoptosis of HCT116 cells. A: Annexin V-positive cells detected by flow cytometry; B: Apoptotic body-positive cells detected by Hoechst 33342 staining (Original magnification: × 200). C: Quantitative analysis of apoptosis detected by flow cytometry; D: Quantitative analysis of apoptotic body-positive cells. *P<0.05, #P<0.01 vs control (0 μmol/L).

Hoechst 33342染色显示，TBG诱导细胞出现染色质凝集，发生核固缩，形成大量典型的凋亡小体（图2B），0.1、1.0、2.5 μmol/L引起细胞凋亡的比例分别是（6.43 ± 0.93）%、（9.57 ± 0.68）%、（14.37 ± 0.85）%（图2D）。结合流式细胞仪分析结果，表明TBG能以剂量依赖的方式促进CRC细胞发生凋亡。

TBG处理24 h，应用荧光探针CM-H2DCFDA观察细胞内ROS，TBG 显著增加细胞内ROS 水平（图3A）；应用JC-1染色监测线粒体膜电位，发现TBG以剂量依赖的方式显著降低CRC细胞线粒体膜电位（图3B）。

图3(Fig.3)

图3 TBG对CRC细胞线粒体膜电位和ROS水平变化的作用 Fig.3 Effects of telocinobufagin on mitochondrial membrane potential and ROS in CRC cells. A: Mitochondrial membrane potential; B: ROS levels; C: Quantitative analysis of mitochondrial membrane potential; D: Quantitative analysis of ROS. *P<0.05, #P<0.01 vs control (0 μmol/L).

应用蛋白免疫印迹检查凋亡相关蛋白表达，结果显示TBG引起HCT116 细胞中p53、Bax 表达显著升高，caspase 9和PARP蛋白出现片段化（图4A）。上述结果说明TBG 诱导p53 和Bax 的活化，导致Caspase 9 和PARP发生剪切进而激活凋亡通路（图4B）。

图4(Fig.4)

图4 Western blotting检测TBG对CRC细胞后凋亡相关蛋白表达的作用 Fig.4 Effects of telocinobufagin on expressions of apoptosis-related proteins in CRC cells. A: Protein expression detected by Western blotting; B: Semi-quantitative analysis of protein expressions. *P<0.05, #P<0.01 vs control (0 μmol/L).

抗体芯片结果显示，TBG显著增加Bad磷酸化和PARP的片段化，与Western blot结果一致。磷酸化IκBα、磷酸化TAK1 以及survivin的蛋白表达在TBG作用下呈下降趋势。上述结果均表明TBG可能通过调节多个应激与凋亡信号分子途径诱导CRC细胞发生凋亡。

蟾酥始载于唐·甄权所著《药性论》，至今已有1400多年历史。明代陈实功著《外科正宗》中蟾酥丸用于治疗痈疽恶疮；《增补万病回春》所录飞龙夺命丹以蟾酥为君药，焦树德先生建议葱白煎汤送服，用于治疗子宫颈癌、肠癌、肺癌等^[7]。然而蟾酥辛、温、有毒，长期服用会产生严重的全身毒性，因此深入研究蟾酥有效成分的抗CRC活性及其机制并进行靶向改造是传统中药减毒增效的创新研发模式^[9]。

TBG 以剂量和时间依赖的方式抑制SW480 和HCT116结肠癌细胞活力。荧光染色标记的凋亡小体，结合流式细胞术结果提示TBG降低CRC细胞活力与其诱导凋亡相关。TBG诱导线粒体膜电位降低并增加细胞内活性氧簇（ROS）水平。HCT116包含一个野生型的p53基因，野生型p53在G1期检查DNA损伤点并启动DNA修复，若修复失败则会诱导细胞凋亡^[10]。p53是ROS诱导细胞凋亡的重要调控因子，ROS可以导致DNA损伤，进而激活共济失调性毛细血管扩张/和Rad3-相关性激酶-p53通路，p53 磷酸化会导致细胞周期分布发生改变，细胞中Bax 表达上升，Bcl-2 表达下降，细胞发生凋亡^[11]。因此，TBG通过激活细胞内重要转录因子p53，上调凋亡相关基因Bax的表达导致凋亡通路的活化^[6]。

聚ADP 核糖聚合酶（PARP）是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶，PARP在DNA损伤断裂时被激活,作为DNA损伤的分子感受器，识别、结合到DNA断裂处，激活、催化受体蛋白的聚ADP核糖基化作用，参与DNA的修复。ROS引起DNA损伤后，有缺口DNA 或DNA 碎片是PARP 的变构效应剂导致PARP与DNA缺口结合，活性可以增加500倍^[12]。TBG可能通过诱导细胞内ROS导致DNA损伤，激活PARP而产生片段化，蛋白免疫印迹和蛋白芯片的结果均显示PARP片段化水平的增高。TBG引起的DNA损伤能够激活BAD的磷酸化^[13]，此前有研究表明顺铂通过细胞外信号调节蛋白激酶，提示TBG引起BAD的磷酸化可能与ROS引起的应激损伤相关。

RIP1被激活并快速募集多种衔接蛋白如TRAF2，泛素化促进TAK1 的磷酸化，刺激IκB激酶IKK 复合体形成，诱导IκBα磷酸化，使NF-κB从胞质转移到核内，诱导凋亡抑制蛋白（IAP）等转录，发挥抑制凋亡作用^{[14, 15]}。TAK1的活化能够引起Wnt通路的活化，而TAK1的抑制则诱导KRAS阳性CRC细胞的凋亡。我们的结果提示TBG可能通过抑制TAK1 和IκBα磷酸化，前者降低KRAS和Wnt通路的活化，后者通过抑制NF-κB通路而产生凋亡诱导作用^{[14, 15]}。存活素是IAP家族成员之一，具有抑制细胞凋亡作用，高表达于大多数恶性肿瘤组织，而在终末分化成熟的正常成人组织中无表达或低表达。存活素通过抑制Caspase-3、Caspase-7阻断细胞凋亡，TBG可能通过抑制NF-κB通路，降低存活素活性进而激活Caspase依赖的通路诱导细胞凋亡^[17]。

综上所述，TBG通过诱导凋亡有效抑制多种CRC细胞增殖。TBG诱导凋亡的作用一方面与其诱导ROS产生，激活p53介导的Bax通路激活导致线粒体外膜通透性有关，另一方面也与抑制TAK1和IκBα，进而阻断IAP通路相关。

图5(Fig.5)

图5 TBG对CRC细胞应激与凋亡信号通路的作用 Fig.5 Effects of telocinobufagin on stress and apoptosis signaling pathway. A: Expression of stress and apoptosis proteins. Red circles indicate upregulated proteins and green ones indicate down-regulated proteins; B: Semi-quantitative analysis of phospho-Bad, cleaved PARP, phospho-TAK1, IKBɑ, phospho-IKBɑ and survivin in telocinobufagin-treated HCT116 cells. *P< 0.05, #P<0.01 vs control (0 μmol/L).